Исследование роли гликозилирования белков оболочки вируса гепатита C в вирусном морфогенезе с использованием бакуловирусной системы экспрессии в клетках эукариот

• Автор: Орлова, Ольга Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 146 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Геномная организация вируса гепатита С

1Л Л. Нетранслируемые области

5’UTR
3’UTR

1 Л.2. Белки ВГС

1Л .2.1. Структурные белки

Кор белок ВГС, структурный белок капсида
Белки оболочки ВГС

1Л.2.2. Неструктурные белки

NS3 и NS4A

1. 2. Жизненный цикл вируса
1.2Л. Проникновение вирусных частиц в клетку
1.2.1.1. Прикрепление и проникновение
CD-81- рецептор
1ЛЭЬЯ - рецептор
811-В1 — рецептор мусорщик
Гликозаминогликаны
1.2.1.2. Выход в цитоплазму и раздевание РНК вирусного генома
1.2.2. Трансляция ВГС и протеолитический процессинг
1.2.3. Репликация ВГС
1.2.4. Сборка вирусной частицы
1.3. Морфогенез вируса гепатита С
1.3.1. Биогенезис гликопротеинов оболочки вируса гепатита С
Посттрансляционный процессинг белков
1.3.2. Гликозилирование гликопротеинов в клетках насекомых
1.3.3. Гликозилирование гликопротеинов в клетках млекопитающих
1.3.4. И-гликаны гликопротеинов ВГС и их роль в функционировании белков оболочки вируса
1.4. Методы исследования гликозилирования белков оболочки ВГС
1.4.1. Сайт-направленный мутагенез ДНК
1.4.2. Получение вирусоподобных частиц ВГС в клетках насекомых
1.4.3. Использование ВасМат системы в клетках млекопитающих
1.5. Модельные системы для изучения вирусного морфогенеза
1.5.1. Ретровирусные псевдочастицы (НСУрр)
1.5.2. Вирусоподобные частицы (НСУ-ЬР)
1.5.3. Система репликонов ВГС

1.5.3.1. Системы репликации с использованием самореплицирующихся РНК. JFH-1 репликоны ВГС
1.5.3.2. Использование бакуловируса для доставки и капсидирования JFH-
РНК в клеткаxHuh-
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Бактериальные клетки, клеточные культуры и плазмиды
2.2. Сайт-направленный мутагенез и создание рекомбинантных конструкций
2.3. Анализ суммарной клеточной ДНК
2.4. Получение микросом
2.5. Электронная микроскопия
2.6. Анализ РНК ВГС с помощью ОТ-ПЦР
2.7. Вестерн-блот и иммуноосаждение
2.8. Анализ гликозилирования — обработка эндогликозидазой Н (Endo Н)
2.9. Получение и очистка вирусоподобных частиц (ВПЧ)
2.10. Центрифугирование в сахарозном градиенте
2.11. Анализ связывания ВПЧ с рецептором CD-
2.12. Флуоресцентная микроскопия и проточная цитофлуориметрия
2.13. Моделирование трехмерной структуры
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Создание набора векторных конструкций, содержащих точечные мутации в сайтах N-гликозилирования белков El и Е2 вируса гепатита С, для экспрессии мутантных белков в клетках насекомых и млекопитающих
3.2. Экспрессия мутантных белков El и Е2 вируса гепатита С в клетках
эукариот с использованием бакуловирусной системы экспрессии
3.2.1. Влияние N-гликанов гликопротеинов El и Е2 ВГС на экспрессию генов мутантных белков в клетках насекомых и млекопитающих
3.3. Исследование роли гликозилирования белков оболочки ВГС в вирусном морфогенезе в клетках насекомых и млекопитающих

мембраны, присоединяясь к нуклеокапсиду. Третья модель "Pull&Push" включает в себя сочетание обоих механизмов присоединения оболочечных гликопротеинов, расположенных в мембране ретикулума, к нуклеокапсиду (Рис.6.)- Предполагается, что присоединение оболочки к нуклеокапсиду у ВГС происходит согласно модели "Pull" [126].
"Pull" "Push" "Pull & Push"
Рис. 6 Модели присоединения интегрированных в мембрану гликопротеинов к нуклеокапсиду у оболочечных вирусов [126].
Поскольку, оболочечные гликопротеины Е1 и Е2 ВГС заякорены в мембране ЭР своими трансмембранными доменами, предполагается, что дальнейшая сборка вириона происходит в ЭР. Структурные белки Е1 и Е2 также были обнаружены в Гольджи, следовательно, заключительный этап созревания ВГС проходит в Гольджи [175]. Кроме того, комплексы N-связанных гликан, мигрирующих сквозь Гольджи, были обнаружены на поверхности вирионов ВГС, выделенных из сыворотки пациента больного гепатитом С [176]. Однако, вирусные частицы подвергаются определенным модификациям в процессе выхода, поскольку при перемещении по секреторному пути их плотность уменьшается. Механизм транзита ВГС из ЭР в Гольджи до сих пор остается неизвестным.
Принято считать, что вирион ВГС покидает клетку секреторным путем, присоединившись к липопротеину низкой плотности, экспортирующего холестерин и триглицерид из гепатоцитов. [176,177]. Помимо липопротеинов низкой плотности, в транспорт вириона ВГС из клетки могут быть вовлечены
эндосомы. Формирование эндосомы зависит от нескольких мультибелковых