Антигенное картирование молекулы гемагглютинина вируса гриппа H5N1 и влияние изменения антигенной структуры на вирулентность

• Автор: Крылов, Петр Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Цели исследования

Научная новизна и практическое значение работы

Основные положения, выносимые на защиту...:

Часть I. Обзор литературы

Часть I. Обзор литературы

Глава I. Общая характеристика строения вирусной частицы

Г лава 2. Структура генома и функциональные свойства белков вируса гриппа А

2.1. РНК-помшеразный комплекс

2.2. 4й сегмент РНК, кодирующий НА
2.3. 5й сегмент РНК кодирующий белок NP
2.4. бй сегмент РНК кодирующий белок NA
2.5. 7й сегмент РНК, кодирующий белки М1 и М2
2.6. 8й сегмент РНК, кодирующий белки NSJ и NS2
Глава 3. Молекулярные основы вирулентности вирусов гриппа птиц для
млекопитающих
Глава 4. Распространение вирусов гриппа А подтипа H5N1 в 1997-2009г
Глава 5. Антигенная структура молекулы НА вируса гриппа А
Часть II. Собственные исследования
Глава 1. Материалы и методы
1.1. Вирусы
1.2. Моноклональные антитела (МКАТ)
1.3. Титрование инфекционности вирусов па куриных эмбрионах
1.4. Реакция гемагглютинации (РГА)
1.5. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
1.6. Получение эскейп-муташпов: селекция и клонирование
1.7. Пассирование вируса на мышах для реадаптации
1.8. Определение 50% летальной дозы вирусов для мышей (ЛД50)
1.9. Получение реассортантов методом скрещивания и селекции
1.10. Получение реассортантов сайт-специфическим мутагенезом
1.11. Постановка полимеразной цепной реакции
1.12. Электрофорез в агарозном геле
1.13. Автоматическое секвенирование
1.14. Программная обработка результатов. Анализ нуклеотидных последовательностей
1.15. Статистическая обработка результатов экспериментов
Глава 2. Результаты
2.1. Антигенное картирование молекулы НА вируса подтипа H5N1
2.1.1. Селекция эскейп-мутантов
2.1.2. Антигенная характеристика полученных эскейп-мутантов в перекрестной РТГА с панелью МКАТ
2.1.3. Секвенирование НА эскейп-мутантов вируса гриппа подтипа H5N1
2.1.4. Перекрестная РТГА эскейп-мутантов вируса A/Mallard/Pennsylvania/10218/84 (H5N2) с панелью МКАТ, использованной для селекции мутантов вируса VNH5N1-PR8/CDC-RG (H5N1)
2.1.5. Построение трехмерной структуры молекулы гемагглютинина подтипа Н5

2.2. Сравнительная характеристика вирулентности эскейп-мутантов при интраназапъном заражении мышей
2.2.1. Вирулентность вируса VNH5N1-PR8/CDC-RG (H5N1) и его эскейп-мутантов для мышей
2.2.2. Вирулентность эскейп-мутантов вируса
А/МаІІагс1/РеппзуІуапіа/10218/84 (Н5П2), селекционированных МКАТ 777/1
2.2.3. Получение реадаптантов и их характеристика
2.3. Реассортационный анализ генетических основ вирулентности низковирулентного эскейп-мутанта и его реадаптированного варианта
2.3.1. Получение реассортантов, содержащих гены НА вируса дикого типа, низковирулентного эскейп-мутанта, и реадаптированного варианта
2.3.2. Определение вирулентности реассортантов
2.4. Характеристика реассортантов, полученных сайт-специфическич мутагенезом и содержащих те же аминокислотные замены в НА, что низковируленптый мутант и его реадаптированный вариант
2.4.1. Получение реассортантов методом сайт-специфического мутагенеза
2.4.2. Определение вирулентности полученных рекомбинантных вирусов
Часть III. Обсуждение результатов
Выводы
Список литературы
Благодарности
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
НА - гемагглютинин.
НА1 - большая субъединица гемагглютинина
НА2 - малая субъединица гемагглютинина
НАО - нерасщепленный гемагглютинин
ВНА - гемагглютин, обработанный бромелаином
NA - нейраминидаза
ГАЕ - гемагглютинирующие единицы
ГТФ, ТТФ, ЦТФ и АТФ - гуанозин-, тимидин-, цитидин-аденозинтрифосфорная кислоты (нуклеозиды)
МКАТ - моноклональные антитела
ЛД50 - 50% летальная доза для мышей
ЭИД50 - 50% эмбриональная инфекционная доза
мРНК - матричная РНК
вРНК - вирионнная РНК
кРНК - комплементарная РНК
дцРНК - двухцепочечная РНК
РНП - рибонуклеопротеид
NES - сигнал ядерного экспорта
ПААТ - полиакриламидный гель
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РГА - реакция гемагглютинации
РТГА - реакция торможения гемагглютинации
ТАЕ - трис-ацетатный буфер
ТЕМЕД - тетраметилдиамин

аминокислотные замены в НА, белке N81 и РВ2, ответственные за уровень вирулентности.
Детальное исследование вирусов, выделенных в 1996-1997 годах в Южном Китае от птиц, позволило пролить свет на происхождение вирусов Н5Ш, вызвавших заболевания у людей. Ген НА вируса подтипа ГОШ, изолированного от гуся в 1996 году (A/goose/Guandong/l/96), оказался почти идентичным гену НА гонконгских вирусов 1997 года, тогда как другие гены имели значительные отличия [216]. Источником гена 1МА подтипа N1 у гонконгских «человеческих» вирусов [78] оказался вирус подтипа Н6К1, выделенный от утки-чирка (АЛеа1/ГОящ КопхуЗ 12/97). Таким образом, вирусы гриппа птиц, послужившие источником заражения людей в Южной Азии в 1997-1999 годах, возникли в результате серии реассортаций при циркуляции вирусов-предшественников у птиц и при переносе вирусов от водоплавающих птиц к перепелкам и курам. Предполагается, что видом, в котором произошли реассортационные события, создавшие патогенный вирус ГОШ, были перепелки, от которых реассортант передался курам [72].
В 2003 году в Юго-Восточной Азии вновь отмечены случаи заражения людей вирусом гриппа птиц подтипа ГОШ. В феврале 2003 года в Гонконге заболели по меньшей мере 2 человека, из которых один погиб. В начале 2004 года страны Юго-Восточной Азии охвачены эпизоотиями, вызванными высоковирулентным вирусом ГОШ. В Таиланде и Вьетнаме зарегистрированы заболевания людей с высокой летальностью (порядка 70%), вызванные этим вирусом. Погибли 24 человека. Вирус, вызвавший эту вспышку, содержал гены НА и ИА, близкие к соответствующим генам вируса 1997 года, хотя и не идентичные им: ген НА претерпел существенные антигенные изменения, напоминающие антигенный дрейф вирусов гриппа человека (что, вообще говоря, не свойственно вирусам гриппа птиц), а ген НА имел делецию. Остальные же гены были получены от иных вирусов гриппа птиц в результате сложной серии реассортаций. Вирус ГОШ 2004