Молекулярные механизмы транскрипции хроматина эукариот

• Автор: Студитский, Василий Михайлович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 56 с. : ил.; 19х14 см

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Транскрипция является первой стадией экспрессии генетического материала в клетках всех организмов. Именно на уровне транскрипции действуют основные механизмы генетической регуляции. Главным ферментом, осуществляющим транскрипцию, является РНК-полимераза (РНКП). Структура РНКП и механизм синтеза РНК высоко консервативны у всех организмов, от бактерий до человека. У эукариот синтез РНК осуществляется на ДНК, организованной в хроматин.
Хроматин состоит из повторяющихся элементов, называемых нуклеосомами. Ядро ("кор") нуклеосомы представляет собой участок ДНК длиной 147 п.н., организованный в
Рис. 1. Изменения структуры хроматина при активации транскрипции. Молчащий хроматин (1) существует в высококонденсированном виде в пределах территории хромосомы (СТ). Сначала он переводится в состояние готовности к транскрипции, т.е. в форму 30 нм фибрилл (2), дальнейшая деконденсация которых происходит при транскрипции (3). Локальные нарушения структуры 30 нм фибрилл хроматина наблюдаются также в регуляторных и промоторных участках, с которыми связываются факторы, специфичные к нуклеотидной последовательности транскрипции, и разрушается нукпеосомная структура.
виде 1.66 сверхспиральных витков на поверхности гистонового октамера, включающего две молекулы коровых гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4. Одна молекула линкерного гистона Н1 связана с ДНК на входе и выходе из кор-нуклеосомы, а также с участками ДНК между соседними нуклеосомами. Нуклеосомы упакованы в 30-нм фибриллы хроматина, которые, в свою очередь, упакованы в пока недостаточно изученные, более компактные структуры.
Компактная структура хроматина существенно затрудняет протекание таких процессов, как репликация, рекомбинация, репарация и транскрипция ДНК in vitro

vivo, при инициации транскрипции и элонгации транскриптов РНК-полимеразой 2 (РНКП2) происходит ремоделирование хроматина. Хотя инициация традиционно считается наиболее регулируемой стадией, недавние исследования показали, что экспрессия многочисленных генов эукариот регулируется на уровне элонгации транскриптов, с участием первой (+1) нуклеосомы и факторов, взаимодействующих с хроматином (показано в лабораториях Адельман (2007) и Йонга (2007)). В то же время, после того, как РНКП2 проходит +1 нуклеосому, транскрипция генов происходит эффективно.
В работах нескольких лабораторий (Бикмор (2004), Вайнтрауба (1985) и Фельзенфельда (1984)) была предложена двухступенчатая модель изменений структуры хроматина, ассоциированных с транскрипцией РНКП2 in vivo (рис. 1). (1) Нетранскрибируемый, высококомпактный хроматин переходит в состояние готовности к транскрипции (30-нм фибриллы, (2)). (3) При транскрипции структура 30-нм
Рис. 2. Структура 30-нм фибрилл хроматина. Цепочка нуклеосом образует соленоид, в котором на виток приходится шесть-восемь динуклеосом. Показана только ДНК. Для сравнения приведен приблизительный размер

мультисубъединичной РНК

полимеразы 2 (РНКП2) и бактериофаговой ЭРб РНКП. При транскрипции РНКП2 нарушается как структура 30-нм фибриллы, так и нукпеосомная структура (вставка).
-30 нм
фибриллы нарушается. Участки ДНК, расположенные между транскрибирующими молекулами РНКП2, остаются связанными с нуклеосомами, за исключением случаев, когда гены транскрибируются с чрезвычайно высокой эффективностью. В то же время, транскрипция генов РНК-полимеразой 3 (РНКПЗ) сопровождается существенно более выраженным нарушением структуры хроматина и, скорее всего, интенсивным обменом всех коровых гистонов.
Структуры 30-нм фибрилл и нуклеосом (рис. 2) несовместимы с процессом транскрипции и должны быть по крайней мере частично разрушены, чтобы РНКП2 могла двигаться вдоль ДНК. Поэтому не удивительно, что транскрипцию хроматина могут облегчать различные факторы, дестабилизирующие хроматиновые фибриллы и нуклеосомы. Эти факторы, способствующие транскрипции ДНК в составе хроматина, остаются недостаточно изученными - за исключением ацетилирования гистонов и удаления гистона Н1 из транскрибируемых генов.

электростатические взаимодействия между октамером и РНКП2 в комплексе ЕС+39. Эта же положительно заряженная область на поверхности гистонового октамера взаимодействует с ДНК в интактной нукпеосоме; эти взаимодействия отсутствуют в комплексе ЕС+39. Следовательно, электростатические взаимодействия РНКП2 с гистонами в комплексе ЕС+39 могут компенсировать ДНК-гистоновые взаимодействия, которые разрушаются в процессе формирования элонгационного комплекса, и стабилизировать комплекс ЕС+39. Сходные взаимодействия могут стабилизировать комплекс ЕС+49.
А “123 -39 -5 +41 +49
+147 Ьр
£со»Т7А1 ЕС Г . ГЛ ™
Инициация/ +AUC + АТФ + ГТФ
ЕС-39 Г
г ЕС-5 ♦ЦТФ
1 ♦УТФ
г —I I
ЕС+41 ог ЕС+49
Б ЕС: -39 -5 +41 +49 +НТФ
Полноразмерный
транскрипт ~*

+42 3

Рис. 27. Экспериментальная система, использованная для остановки РНКП E. coli в различных позициях на 603 нуклеосомной ДНК. А. РНКП останавливали в различных позициях на двух вариантах нуклеосомной матрицы 603 с различными последовательностями ДНК (603-42 и 603-49) в присутствии различных комбинаций нукпеозидтрифосфатов. Остановку РНКП проводили в позициях -39, -5 (обе матрицы), +41 или +49. Б. Активный элонгационный комплекс может быть остановлен в различных позициях на нуклеосомной ДНК. Анализ элонгационных комплексов, формируемых RNAP E.coli на нукпеосомах 603. Анализ пульс-меченой РНК с помощью денатурирующего ПААГ-электрофореза. Активные элонгационные комплексы содержат РНК, синтез которых может быть продолжен. Опыты по продолжению транскрипции были проведены при концентрации 1М KCI для того, чтобы разрушить нуклеосому и облегчить транскрипцию.
Если отрицательно заряженная область на поверхности РНКП2 важна для
корректной транскрипции хроматина, то можно ожидать, что эта область является консервативной у РНКП2 и РНКП E. coli, которые осуществляют транскрипцию