Анализ соматических мутаций в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF в клетках опухолей различной локализации с использованием биочипов

• Автор: Емельянова, Марина Александровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 137 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Раздел 1.1 Таргетная терапия
1.1.1 Ингибиторы рецептора эпидермального фактора роста в
противоопухолевой терапии
1.1.2 Ингибиторы других участников EGFR-зависимого сигнального каскада
Раздел 1.2 Структурно-функциональная характеристика участников EGFR-
зависимого сигнального каскада
1.2.1 Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR)
1.2.1.1 Структурно-функциональная характеристика гена EGFR
1.2.1.2 Структурно-функциональная характеристика белка EGFR
1.2.1.3 Клинически значимые мутации в гене EGFR
1.2.2 Малая сигнальная ГТФ-аза (KRAS)
1.2.2.1 Структурно-функциональная характеристика гена KRAS
1.2.2.2 Структурно-функциональная характеристика белка KRAS
1.2.2.3 Клинически значимые мутации в гене KRAS
1.2.3 Фосфоинозитид-З-киназа, каталитическая субъединица (РІКЗСА)
1.2.3.1 Структурно-функциональная характеристика гена РІКЗСА
1.2.3.2 Структурно-функциональная характеристика белка РІКЗСА
1.2.3.3 Клинически значимые мутации в гене РІКЗСА
1.2.4 Серин/треонин протеинкиназа (BRAF)
1.2.4.1 Структурно-функциональная характеристика гена BRAF
1.2.4.2 Структурно-функциональная характеристика белка BRAF
1.2.4.3 Клинически значимые мутации в гене BRAF
1.2.5 Распространенность мутаций в генах EGFR, KRAF, РІКЗСА и BRAF в
опухолях человека различной локализации
Раздел 1.3 Молекулярно—генетические методы диагностики соматических мутаций
Раздел 1.4 Биологические микрочипы и их применение
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Клинический материал
2.2 Экстракция ДНК
2.2.1 Экстракция ДНК из ткани, фиксированной в парафиновых блоках
2.2.2 Экстракция ДНК из свежезамороженной ткани
”2.3 Конструирование и синтез о лигонуклеоти до в
2.3.1 Конструирование и синтез праймеров
2.3.2 Конструирование и синтез LNA-олигонуклеотидов
2.3.3 Конструирование и синтез зондов для иммобилизации на биочипах.

2.4 Изготовление биологических микрочипов
2.5 Сайт-направленный мутагенез
2.5.1 Двухэтапный сайт-направленный мутагенез
2.5.2 Одноэтапный сайт-направленный мутагенез
2.6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.7 Гибридизация меченого продукта на биочипе
2.8 Регистрация изображения и анализ результатов гибридизации
2.9 Электрофоретическое разделение продуктов амплификации в агарозном

2.10 Секвенирование
2.11 Статистический анализ
2.12 Другие методы определения мутаций
2.12.1 Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ)
2.12.2 Секвенирование с предварительным обогащением образца мутантной

2.12.3 Аллель-специфичная ПЦР в реальном времени
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Раздел 3.1 Разработка метода анализа соматических мутаций на основе
биологических микрочипов
3.1.1 Конструирование системы амплификации для анализа целевых
последовательностей генов
3.1.1.1 Разработка системы праймеров для проведения двухэтапной
мультиплексной ПЦР
3.1.1.2 Конструирование LNA-олигонуклеотидов и выбор их оптимальной
концентрации в ПЦР-смеси
3.1.1.3 Создание контрольных ДНК-матриц, содержащих мутации в генах EGFR,
KRAS, В RAF и PIK3CA
3.1.2 Разработка олигонуклеотидных микрочипов
3.1.2.1 Конструирование олигонуклеотидных зондов для иммобилизации на
микрочипах
3.1.2.2 Конструирование специализированных биочипов
3.1.2.2.1 Анализ мутаций в гене EGFR
3.1.2.2.2 Анализ мутаций в гене KRAS
3.1.2.2.3 Анализ мутаций в генах PIK3CA и В RAF
3.1.2.2.4 Биочип для анализа мутаций в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF
3.1.3 Определение аналитической чувствительности метода
-Раздел 3.2-Гепотипирование клинических образцов
3.2.1 Генотипирование образцов опухолей поджелудочной железы
3.2.1.1 Анализ мутаций в гене KRAS с помощью биочипов
3.2.1.2 Выявление ассоциаций между наличием мутаций в гене KRASи клинико-

анамнестическими характеристиками пациентов с опухолями ПЖ
3.2.1.3 Верификация результатов генотипирования образцов опухолей ПЖ на
наличие мутаций в гене KRAS
3.2.2 Генотипирование образцов колоректального рака
3.2.2.1 Анализ мутаций в генах KRAS, В RAF и PIK3CA с помощью биочипов
3.2.2.2 Выявление ассоциаций между молекулярно-генетическим статусом опухоли и клинико-анамнестическими характеристиками больных КРР
3.2.2.3 Верификация результатов генотипирования образцов КРР на наличие
мутаций в гене KRAS
3.2.3 Генотипирование образцов меланомы
3.2.3.1 Анализ мутаций в генах PIK3CA и BRAF
3.2.3.2 Выявление ассоциаций между молекулярно-генетическим статусом
опухоли и клинико-анамнестическими характеристиками больных меланомой
3.2.3.3 Верификация результатов генотипирования образцов меланомы на
наличие мутации V600E в гене BRAF
3.2.4 Генотипирование образцов HMPJI
3.2.4.1 Анализ мутаций в образцах HMPJI с помощью биочипов
3.2.4.1.1 Анализ свежезамороженных опухолевых биопсий НМРЛ на наличие
мутаций в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF
3.2.4.1.2 Анализ фиксированных в парафиновых блоках образцов НМРЛ на
наличие мутаций в генах EGFR и KRAS
3.2.4.2 Выявление ассоциаций между молекулярно-генетическим статусом опухоли и клинико-анамнестическими характеристиками больных НМРЛ..
3.2.4.3 Верификация результатов генотипирования образцов НМРЛ на наличие
мутации в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и BRAF
3.2.5 Различие в спектре мутаций в гене KRAS в опухолях различной
локализации
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Ген BRAF относится к семейству RAF-генов. В него входят всего три гена - ARAF, В RAF и CRAF, кодирующие серин/треониновые протеинкиназы (Zebisch & Troppmair, 2006). Каждый из RAF генов имеет свой профиль экспрессии, что позволяет предположить, что разные RAF-изоформы выполняют различные, вполне определенные, функции (Chong et ed., 2003). Ген CRAF экспрессируются повсеместно (Сауо et al., 2007), ARAF и BRAF имеют более ограниченные профили экспрессии. Максимальный уровень экспрессии гена ARAF наблюдается в органах урогенитального тракта, включая почки, яичники, простату и придатки яичек, а максимальный уровень экспрессии BRAF наблюдается в селезенке, нервной, тестикулярной и гемопоэтических тканях (Acton, 2013).
Псевдоген гена BRAF, названный BRAF2, локализован на участке q 13 Х-хромосомы и кодирует неактивный белок (Eychene et al., 1992).
1.2.4.2 Структурно-функциональная характеристика белка BRAF
Серин/треонин протеинкиназа BRAF (Roskoski, 2010), состоит из 651а.к. и имеет молекулярную массу 72,5 kDa (Sithanandam et al., 1990). Каждая протеинкиназа семейства RAF включает три консервативных региона (CR): CR1, CR2 и CR3 (рис. 14А) (Wellbrock et al., 2004). CR1 включает RAS-связывающий домен (RBD) и цистеин-богатый домен (Cys). CR1 взаимодействует с RAS и с мембранными фосфолипидами. CR2 представляет собой серин/треонин-богатый домен. Он содержит сайт связывания с регуляторным белком 14-3-3. CR3 - каталитический домен, локализований вблизи С-терминального конца белка. После CR3 располагается еще один сайт связывания с 14-3-3 (Roskoski, 2010).
BRAF характеризуется большей киназной активностью к своему субстрату МЕК, чем CRAF и ARAF, а его активация требует меньшего количества событий фосфорилирования. Активация BRAF происходит в результате связывания с ГТФ-азами семейства RAS и последующего фосфорилирования Thr 599 и Ser 602 в активационном сегменте киназного домена (Wan et al., 2004; Zhang & Guan, 2000; Hmitou et al., 2007). В покоящихся клетках BRAF пребывает в инактивированной конформации из-за автоингибирующего взаимодействия между киназным доменом и N-концевым регуляторным регионом, которое прекращается в результате связывания с GTP-Ras (Tran et al., 2005). Изначально данный механизм был описан для CRAF. BRAF отличается от CRAF тем, что за исключением Т599 и S602, для его активации не требуется