Структура, стабильность и комплексообразование сахар-связывающих белков с лигандами. Возможность их использования в качестве чувствительного элемента биосенсорных систем на глюкозу

• Автор: Фонин, Александр Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 98 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Цели и задачи исследования

Основные положения, выносимые на защиту:

Научная новизна работы

Теоретическое и практическое значение работы

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Нативные частично неупорядоченные белки

1.2. Лиганд-связывающие белки из периплазмы грам-отрицательных бактерий

1.2.1. О-глюкоза/О-галактоза-связывающий белок
1.2.2. Трегалоза/мальтоза - связывающий белок
1.3. Методы мониторинга глюкозы
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.2. Методы
2.2.1. Анализ пространственной структуры белков
2.2.2. Флуоресцентные измерения
2.2.3. Регистрация и анализ кривых затухания флуоресценции
2.2.4. Измерение спектров кругового дихроизма
2.2.5. Тушение флуоресценции акриламидом
2.2.6. Определение параметров связывания лиганд-рецептор с помощью интенсивных флуоресцентных характеристик
2.2.7. Расчет термодинамических параметров
2.2.8 Дифференциальная сканирующая калориметрия
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Роль лигандов в стабилизации структуры ССВР
3.1.1. Сворачивание-разворачивание апо и холоформы ССВР под действием С(1пНС
3.1.2. Тепловая денатурация ССВР и ССВР/ас
3.2. Влияние аминокислотных замен в положение 16 и 183 на стабильность ССВР и комплексообразование этого белка с глюкозой
3.2.1. Устойчивость ССВРАУ183А и ССВР/ПбА к денатурирующему действию гуанидингидрохлорида
3.2.2. Тепловая денатурация мутантных форм ССВР/И/183А и ССВР/ПбА, а также комплексов этих белков с глюкозой
3.3. Структура и стабильность ТМВР
3.4. Возможность использования сахар-связывающих белков ССВР и ТМВР в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
BAD AN - 6-бромацетют-2-диметиламинонафталин;
GGBP - D-глюкозаЛЗ-галактоза-связывающий белок из Escherichia coir,
GGBP-Ca - В-глюкоза/В-галактоза-связывающий белок из Escherichia coli с отщепленным ионом Са;
Glc - глюкоза;
GGBP/Glc - комплекс GGBP с глюкозой;
GGBP/Glc-Ca - безкальциевая форма комплекса D-глюкоза/В-галактоза-связывающего белка с глюкозой;
GGBP/X Y - мутантная форма D-глюкоза/В-галактоза-связывающего
белка с заменой аминокислотного остатка X на Y;
GGBP/X Y-BADAN - мутантная форма D-глюкоза/В-галактоза-связывающего белка с заменой аминокислотного остатка X на Y с присоединенным флуоресцентным красителем BAD AN;
FRET - безызлучательный перенос энергии по ферстеровскому механизму;
GdnHCl - гуанидингидрохлорид;
ТМВР - трегалоза/мальтоза-связывающий белок из Thermococcus litoralis.
АНС -8-анилино-1-нафталин сульфат

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследования
В течение последнего десятилетия представления о том, как осуществляется фолдинг белков, и даже представления о нативном белке как о белке с жесткой, строго детерминированной структурой, претерпели существенное изменение. На рубеже столетий стали появляться работы, свидетельствующие о том, что полипептидные цепи многих белков в принципе не способны образовывать компактное глобулярное состояние. Тем не менее, такие белки, будучи частично или полностью неупорядоченными, выполняют в клетке присущую им функцию, т.е. являются нативными [1-3]. Эти белки могут переходить в компактное глобулярное состояние только при взаимодействии со своими партнерами: низкомолекулярными лигандами, другими белками, нуклеиновыми кислотами и т.д. В связи с этим изучение влияния лигандов на стабильность и процесс фолдинга белков представляет значительный интерес.
Двухдоменные лиганд-связывающие белки периплазмы грам-отрицательных бактерий (РВР) могут быть удобной моделью для изучения роли лигандов в процессах фолдинга и стабилизации структуры белков в нативном состоянии. Эти белки участвуют в переносе различных веществ (углеводов, аминокислот, пептидов) через клеточную мембрану, используя энергию, высвобождаемую в результате гидролиза АТФ. Отличительной особенностью РВР, выделяющей их из других классов белковых рецепторов, являются значительные изменения пространственной структуры при взаимодействии со своими лигандами [4]. Понимание механизмов комплексообразования этих белков и роли лигандов в процессах их фолдинга и стабилизации структуры особенно важно в связи с возможностью их использования в качестве чувствительных элементов биосенсорных систем на ряд аналитов, в частности, на глюкозу.

раствор Л'-ацетилтриптофанамида [78]. Вклад /-той компоненты в суммарное излучение определяли как:
Среднеквадратичную величину времени жизни флуоресценции (г) для мультиэкспоненциального затухания определяли из соотношения:
2.2.4. Измерение спектров кругового дихроизма
Измерение спектров КД проводили с использованием спектрополяриметра .1-810 (7азсо, Япония). Для измерения спектров КД в дальней УФ-области использовали кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 мм, измерение проводили в области 250 - 190 нм с шагом 0.1 нм. Для измерения спектров КД в ближней УФ-области растворов ОВР использовали кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см, измерение проводили в области 320 - 250 нм с шагом 0.5 нм. При измерении спектров КД в видимой и ближней УФ-области растворов флуоресцентных белков использовали кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см, измерение проводили в области 600 - 250 нм с шагом 1 нм. Для улучшения соотношения сигнал/шум каждый спектр регистрировали 3-5 раз и полученные данные усредняли. Спектры КД белков построены с учетом КД соответствующего буферного раствора.
Молярная эллиптичность на аминокислотный остаток рассчитывали исходя из экспериментально полученных значений эллиптичности в в соответствии с формулой:

| ехр(-/ / г()<Л

(2.3)

(2.4)
(2.5)