Вирус простого герпеса типа 1 человека : молекулярно-генетический анализ причин резистентности и поиск новых ингибиторов

• Автор: Коровина, Анна Николаевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 89 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Вирус простого герпеса первого типа: общая характеристика, жизненный цикл и репликация
Общая характеристика семейства Herpesviridae
Структура вириона ВПГ-
Структура генома ВПГ-
Жизненный цикл, экспрессия генов и репликация ВПГ-
ДНК-полимераза ВПГ-
Ингибиторы репликации вируса герпеса: клинические препараты и
лабораторные разработки
Клинически одобренные антигерпетические препараты
Поиск новых антигерпетических препаратов
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клеточные культуры
Приготовление компетентных клеток E. coli
Трансформация бактериальных клеток
Манипуляции с плазмидной ДНК
Выделение геномной ДНК
Полимеразная цепная реакция
Конструирование плазмид
Молекулярно-генетический анализ нуклеотидных последовательностей
Получение лабораторных клонов ВПГ-1 устойчивых к ACV (Lz/R) и HpACV (1-7)
Экспрессия белка в клетках E. coli
Работа с клетками НЕК293Т
Трансфекция клеток НЕК293Т
Детекция целевой мРНК
Получение рекомбинантной бакмиды
Работа с клетками Sß
Получение вирусных стоков
Экспрессия белка в клетках Sß
Очистка белка
Ингибирование реакции элонгации, катализируемой ДНК-полимеразой ВПГ или
ОТ ВИЧ
Субстратная специфичность ДНК-полимеразы ВПГ
Субстратная специфичность ОТ ВИЧ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Молекулярно-генетический анализ ДНК-полимераз и тимидинкиназ из
клинических и лабораторных изолятов ВПГ-
Филогенетический анализ
Чувствительность штаммов к антигерпетическим агентам
Мутации в тимидинкиназе
Мутации в ДНК-полимеразе
Экспрессия и выделение ДНК полимеразы ВПГ
Экспрессия ДНК-полимеразы ВПГ в прокариотических системах
Экспрессия и выделение ДНК-полимеразы ВПГ в бакуловирусной системе
Поиск новых антигерпетических препаратов
Антигерпетическая активность фосфонатных аналогов нуклеозидов

Ингибирование ДНК-полимеразы ВПГ 2Т-нуклеотидами
Антигерпетическая активность производных триазинов
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

ВВЕДЕНИЕ
Заболевания человека вызывают девять видов вирусов семейства Негреястпбае. Из них наибольшее распространение с древнейших времён получил вирус простого герпеса первого типа (ВПГ-1), результатом чего стала тихая и плохо контролируемая пандемия заболеваний кожных и слизистых покровов человека. В некоторых регионах вирусом инфицировано от 51% до 100% населения (1). ВПГ-1 обычно находится в латентном состоянии, но в благоприятных условиях реактивируется и становится причиной таких заболеваний, как оральный и генитальный герпес, конъюнктивит, кератит, инфекционный энцефалит, синдром Капоши. Кроме того, наряду с цитомегаловирусом, папилломавирусом, туберкулёзной палочкой, вирус герпеса часто сопровождает ВИЧ, что значительно осложняет лечение пациентов. По некоторым данным вирус также участвует в развитии рассеянного склероза (2), может приводить к мужскому бесплодию (3) и болезни Альцгеймера (4,5). В случае новорожденных и иммунодефицитных пациентов заболевания, вызванные ВПГ-1 могут представлять серьёзную опасность.
Инфекция ВПГ-1 передаётся при личном контакте, воздушно-капельным, половым, трансплацентарным (от матери к плоду) путями.
Большинство современных препаратов для лечения герпетических инфекций основано па использовании в качестве лекарственных средств модифицированных нуклеозидов или их депо-форм (6). Депо-формы (ргобпщя) представляют собой соединения, сами по себе не проявляющие антивирусного действия, которые после проникновения в инфицированную клетку, в результате химических или ферментативных превращений, образуют активные ингибиторы жизненного цикла вируса. Действие препаратов направлено, главным образом, на подавление синтеза вирусной ДНК, катализируемого основным ферментом репликации - ДНК-полимеразой. В настоящее время для лечения ВИЧ-инфицированных больных одобрены пять препаратов нуклеозидной природы и один ненуклеозидный препарат. Золотым стандартом антигерпетической терапии является ацикловир АСУ (7). Следует отметить, что эти препараты не избавляют пациентов от рецидивирующего характера течения болезни, а результатом их длительного приёма может стать возникновение резистентных штаммов вируса. До 30% пациентов, перенесших пересадку костного мозга, и 6-10% ВИЧ-инфицированных являются носителями штаммов ВПГ-1, резистентных к ацикловиру и другим антигерпетическим препаратам

Для получения белка в эукариотической системе использовали клетки Sfi> («Invitrogen», США).
Приготовление компетентных клеток E. coli
Ночную культуру E. coli, выращенную в среде SOB (20 г/л бактотриптон, 5 г/л дрожжевой экстракт, 0,5 г/л NaCl, 2,7 мМ КС1, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgS04) при 37°С, переносили в 100 мл среды SOB в соотношении 1:100 и выращивали при комнатной температуре ДО достижения оптической ПЛОТНОСТИ культуры ODs50=0,4-0,5 (при длине оптического пути 1 см). Полученную культуру инкубировали во льду 5 мин и центрифугировали при 3200 об./мин в течение 10 мин при 4°С на центрифуге Eppendorf. Осадок ресуспендировали в 30 мл стерильного холодного буфера TFB1 (100 мМ RbCl, 50 мМ МпС12, 30 мМ СН3СООК, 10 мМ СаС12, 15% (v/v) глицерин, pH 5,8). Суспензию выдерживали 90 мин во льду, центрифугировали 5 мин при 3200 об/мин и ресуспендировали осадок в 4 мл стерильного холодного буфера TFB2 (10 мМ MOPS, 10 мМ RbCl, 75 мМ СаС12, 15% (v/v) глицерин, pH 6,8). После инкубации полученной суспензии во льду в течение 10 мин, её аликвоты (200 мкл) переносили в стерильные пробирки и замораживали в жидком азоте. Полученные компетентные клетки хранили при -80°С.
Трансформация бактериальных клеток
Аликвоту (20 мкл) компетентных клеток размораживали во льду, прибавляли -200 нг ДНК, плазмидной или в составе лигазной смеси, и инкубировали 30 мин. Трансформацию проводили мотодом теплового шока, которое заключается в инкубации клеток при 42°С в течение 45 сек с последующим охлаждением во льду в течение 2 мин. После прибавления к аликвоте 800 мкл среды LB (10 г/л NaCl, 10 г/л бакто-триптон, 5 г/л дрожжевой экстракт) клетки растили при встряхивании 40-60 мин при 37°С, высевали на чашки Петри с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина или 50 мкг/мл канамицина, 7 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл тетрациклина, 100 мкг/мл X-gal и 40 мкг/мл IPTG, сушили и выращивали колонии в течение 15-18 часов при 37°С.
Манипуляции с плазмидной ДНК
Все манипуляции с ДНК (расщепление эндонуклеазами рестрикции II типа, лигирование, анализ ДНК методом горизонтального электрофореза в агарозном геле) проводили в соответствии со стандартными методиками (109). Выделение ДНК из