Вирусоподобные наноразмерные частицы - носители антигенов вирусов гриппа и краснухи

• Автор: Котляров, Роман Юрьевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с. : ил.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Вирусоподобные частицы как основа создания новых вакцин
2. Конструирование вирусоподобных частиц на основе ядерного антигена вируса 12 гепатита В
3. Перспективы создания рекомбинантных вакцин против краснухи
4. Перспективы создания противогриппозных вакцин
5. Растения как «биофабрики»
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Продукция вакцинных белков El и El2 вируса краснухи в клетках E. coli
2. Конструирование вирусоподобных НВс-частиц, представляющих на своей поверхности эпитопы Е1 белка вируса краснухи и их получение в E. coli
3. Конструирование вирусоподобных НВс-частиц, представляющих на своей поверхности внеклеточный домен М2 белка вируса «свиного» гриппа и их получение в E. coli
4. Создание самореплицирующихся вирусных векторов для экспрессии целевых белков в растениях
5. Создание фитовирусных систем экспрессии вакцинных белков вирусов краснухи и гриппа в растениях. ’
ОБСУЖДЕНИЕ
1. Конструирование вирусоподобных частиц на основе НВс-антигена — носителей эпитопов
2. Оптимизация вирусных систем экспрессии рекомбинантных белков в растениях
3. Функциональные характеристики вирусоподобных НВс частиц - носителей эпитопов вирусов краснухи и гриппа
ВЫВОДЫ
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
В настоящей работе применяют следующие определения, обозначения и сокращения:
gfp - ген зеленого флуоресцентного белка
GFP - зеленый флуоресцентный белок
tet - ген устойчивости к тетрациклину
НТР — нетранслируемый район мРНК
ХВК - X вирус картофеля
Sgpl - первый субгеномный промотор ХВК
RDRP - РНК зависимая РНК полимераза ХВК
ОТ-ПЦР - обратная транскрипция с последующей полимеразой цепной реакцией ВТМ - вирус табачной мозаики
AMV - 5’-нетранслируемая (лидерная) последовательность РНК 4 вируса мозаики люцерны
Е1 - поверхностный гликопротеин вируса краснухи Е12 — эпитоп вируса краснухи (154-239 аминокислоты белка Е1)
НВс - ядерный антиген вируса гепатита В
М2е - внеклеточный домен М2 белка вируса гриппа
ВПЧ - вирусоподобная частица

Человечество использует вакцины на протяжении многих веков. Однако в современном понимании, первая вакцина и процедура вакцинации была изобретена в конце 18 века, а термин «вакцина» появился еще век спустя. Самым первым прототипом вакцины было использование ослабленной формы возбудителя заболевания. Позднее были разработаны способы химической и физической обработки микроорганизмов, позволяющие их обезвредить, но сохранить иммуногенные свойства. Следующим этапом явилось создание белковых вакцин, то есть вакцин, использующих один или несколько белков или даже их отдельных фрагментов-эпитопов патогенного организма. Этот подход позволяет создавать безопасные вакцины, так как риск реверсии к патогенной форме сводится к нулю. Однако вследствие значительных отличий в генерации иммунного ответа против целого патогена и против отдельных белков, подобные вакцины могут вызывать гораздо менее выраженный иммунный ответ, чем в случае использования аттенуированных или инактивированных возбудителей.
Решением этой проблемы может являться направленное конструирование наноструктур, имитирующих патоген и содержащих отдельные белки патогена на поверхности частицы-носителя. Данный подход позволяет использовать преимущества белковых вакцин и нивелировать их недостатки, имитируя взаимодействие вируса с иммунной системой.
В качестве носителей антигенов могут быть использованы как искусственные структуры, так и объекты биологического происхождения. Способность биологических макромолекул к самосборке и самоорганизации является одной из отличительных черт живых систем и предоставляет поистине неисчерпаемые возможности для использования биомолекул в качестве «строительных» блоков «молекулярного конструктора» для направленного создания новых наноархитектур с заданными пространственными и функциональными свойствами. Одним из наиболее ярких примеров таких структур, обладающих четкой симметрией, обширными возможностями направленной модификации современными методами генной инженерии являются вирусные частицы и имеющие сходную структуру вирусоподобные частицы (ВПЧ), образуемые в результате самособорки кап-сидных белков вирусов. В отличие от вирусов, такие вирусоподобные частицы не содержат генетического материала и являются полностью безопасными. С использованием методов генетической инженерии можно получить «химерные» капсидные белки, к которым присоединен целевой антиген, в результате самосборки таких гибридных белков могут быть получены рекомбинантные ВПЧ, на поверхности которых представлен целевой ан-

2. Конструирование вирусоподобных НВс-частиц, представляющих на своей поверхности эпитопы El белка вируса краснухи и их получение в E. coli.
В качестве основы для создания вирусоподобных частиц — носителей эпитопов El белка был использован ядерный антиген вируса гепатита В (НВс - антиген). Мономеры этого белка, состоящие из 183 а.о., собираются в икосаэдрические частицы диаметром 34 нм, состоящие из 240 субъединиц, организованных в димерные блоки (Wynne et al., 1999). Последовательность НВс содержит аргинин-богатый С-концевой домен, связывающий вирусную ДНК при сборке вириона, при экспрессии в E. coli этот домен связывает бактериальную РНК (Wingfield et al., 1995), наличие которой в вакцинном препарате нежелательно. Поскольку С-концевой домен (а.о. 150-183) не требуется для сборки частиц (Zheng et al., 1992), он был удален и заменен остатком цистеина, введение которого повышает стабильность НВс частиц (De Filette et al., 2006). Два района НВс могут быть использованы для презентации чужеродных пептидов на поверхности НВс частиц, - N конец белка и иммунодоминантная петля, расположенная между 75 и 85 аминокислотными остатками белка (Kratz et al., 1999; Murray and Shiau, 1999; Pumpens and Grens, 2001). Поэтому для презентации El-эпитопов было сконструировано две серии рекомбинантных генов, кодирующих гибридные НВс белки, содержащие вставку эпитопа либо на N-конце, либо в им-мунодоминантной петле.
Для клонирования эпитопов использовали два рекомбинантных вектора на основе pQE60, в которых были клонированы последовательности НВс. Первый вектор, pQE60_HBc, позволял клонировать кодирующую эпитоп последовательность на 5-конце гена НВс в сайте Ncol (Рнс. 17). Во втором векторе, pQE60-HBc(BA), в нммунодоминант-ную петлю была введена последовательность сайтов BamHI и Apal, что позволяет клонировать эпитопы в иммунодоминантной петле НВс антигена (Рис. 18).
Нуклеотидная последовательность, кодирующая эпитоп Е12 (нт 460-717 гена El), была амплифицирована с помощью ПЦР. В качестве матрицы был использован препарат кДНК вируса краснухи. Получали два ПЦР-фрагмента: E12_Nco для клонирования на N-конец НВс и Е12_ВА для клонирования в район иммунодоминантной петли НВс. Амплификацию проводили с праймерами E12_Nco_F, E12_Nco_R и Е12-Ваш, Е12_Ара, соответственно. Полученные ПЦР фрагменты были клонированы в плазмидных векторах pGEM-Т (Promega) и секвенированы. На следующем этапе Ncol и BamHI-Apal фрагменты из полученных плазмид, соответствующие последовательностям эпитопа Е12, были клонирован в первом случае в векторе pQE60-HBc по сайту Ncol, в втором случае в векторе