Регуляции экспрессии микроРНК в составе кластеров и пиРНК, индуцированных встраиванием мобильных элементов, у Drosophila melanogaster

• Автор: Рязанский, Сергей Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил.

Содержание
Список сокращений
1. Общая характеристика работы
1.1. Актуальность темы
1.2. Цели и задачи работы
1.3. Научная новизна и практическая значимость работы
1.4. Апробация работы
1.5. Объём диссертации
2. Литературный обзор
2.1. Механизмы образования и действия миРНК
2.2. Роль миРНК в клетках
2.3. Механизмы регуляции экспрессии миРНК животных
2.3.1. Регуляция транскрипции генов миРНК
2.3.2. Регуляг/ия процессинга при-миРНК до пре-миРНК
2.3.3. Редактирование миРНК
2.3.4. Регуляция стабильности факторов образования миРНК
2.3.5. Авторегуляторные петли
2.3.6. Сложные взаимоотношения Lin28 и let-
2.3.7. Регуляция экспрессии кластеров миРНК
2.4. Происхождение, образование и функции пиРНК
2.4.1. Источники пиРНК в яичниках дрозофилы
2.4.2. Первичный процессинг пиРНК
2.4.3. Амплификация пиРНК по механизму «пинг-понг»
2.4.4. Биологические функции пиРНК
3. Материалы и методы
3.1. Биоинформатические методы
3.1.1. Использованные библиотеки коротких РНК
3.1.2. Обработка библиотек коротких РНК
3.1.3. Обработка данных по уровню экспрессии миРНК
3.1.4. Предсказание промоторов кластеров миРНК
3.1.5. Филогенетическая реконструкция эволюции кластеров миРНК
3.1.6. Выявление коротких РНК из фланкирующих последовательностей МЭ
3.1.7. Выявление МЭ, специфичных для линий

3.2. Молекулярно-биологические методы
3.2.1. Использованные линии D. melanogaster
3.2.2. Выделение РНК
3.2.3. Выделение геномной ДНК
3.2.4. Реакция обратной транскрит/ии
3.2.5. Полимеразная цепная реакция
3.2.6. Количественный ПЦР в реальном времени
3.2.7. Обратный ПЦР
3.2.8. Нозерн-блот гибридизация
3.2.9. Секвенирование библиотек коротких РНК
3.2.10. Секвенирование генома линии wK
3.2.11. Последовательности использованных олигонуклеотидов
4. Результаты
4.1. Общая характеристика кластеров миРНК Drosophila melanogaster
4.2. Корреляция тканевых профили экспрессии миРНК кластеров
4.3. Некоординированная экспрессия миРНК некоторых кластеров
4.4. Поиск промоторов кластеров миРНК
4.5. Корреляции профилей экспрессии миРНК и миРНК*
4.6. Идентификация семенник-специфичных миРНК
4.7. Эволюция кластера miR
4.8. Встройка МЭ в эухроматин индуцирует образование коротких РНК
4.9. Характеристика коротких РНК, индуцированных инсерцией МЭ
4.10. Образование коротких РНК из флангов зависит от факторов биогенеза пиРНК
4.11. Предсказание сайтов встройки МЭ
4.12. МЭ индуцируют образование коротких РНК в близлежащих генах
5. Обсуждение
6. Выводы
7. Список литературы
Список сокращений
миРНК — микроРНК; microRNA, miRNA
пре-миРНК — предшественник миРНК; precursor miRNA, pre-miRNA при-миРНК — первичный предшественник миРНК; primary precursor miRNA, pri-miRNA
пиРНК — короткие РНК, взаимодействующие с Piwi; Piwi-interacting RNAs, piRNA
siPHK — короткие интерфирирующие РНК; small interference RNA, siRNA shPHK — короткие шпилечные РНК; small hairpin RNA, shRNA дцРНК — двухцепочечная РНК
miRISC — миРНК-индуцированный комплекс подавления; miRNA-induced
silencing complex
Ago — белки Argonaute
МЭ — мобильный элемент
мРНК — матричная РНК
З’-НТО — 3' нетранслируемая область мРНК
ОРФ — открытая рамка считывания
п.о. - пара оснований
т.п.о. - тысяча пар оснований
нт. - нуклеотид
TSS — сайт инициации транскрипции; transcription start site

2.4.1. Источники пиРНК в яичниках дрозофилы
Основным источником происхождения пиРНК дрозофилы являются специальные участки генома, обогащенные полноразмерными копиями и разрушенными фрагментами МЭ. Такие участки получили названия «мастер-локусы», или «кластеры пиРНК» (Brennecke et al., 2007). Кластеры пиРНК расположены на границе между эу- и гетерохроматином в перицентромерных и субтеломерных участках. Считается, что они транскрибируются полимеразой Pol II с образованием длинного транскрипта, предшественника пиРНК, который кэпируется, полиаденилируется, и даже аодверхается алыернашвному сплайсингу (Goriaux ct al., 2014, Kawaoka et al., 2013). В дальнейшем такие транскрипты процессируют до пиРНК (см. далее раздел 2.4.2).
Овариолз

Нуаж Фолликулярные клетки Ооцмт
Соматический мастер-локус
Мастер-локус ftamenko
Распределение плотности уникальных пиРНК

Содержание
транслозонов, %

Хромосома X
Г Герминальный мастер-локус
Хромосома
4 3 2 1 2 3

100%1 4 Содержание транспозонов, %
ю%- 1 Jit . 1 іішіик. іііУьїкі ішМ
200-100 - Распределение плотности уникальных пиРНК 1 И -Мастер-локус 42АВ
100 гос- 1 ?“р пиРНК на + цепи
- пиРНК на - цепи
Рисунок 5. Мастер-локусы пиРНК в герминальных и соматических клетках яичников дрозофилы (с изменениями из (Вгеплеске е1 а1., 2007; Бюгм е1 а1, 2011)). (А) Яичники дрозофилы являются парными органами, структурной единицей которых являются овариолы. Овариола представляет собой цепочку яйцевых камер, каждая из которых окружена соматическими фолликулярными клетками. Внутри яйцевых камер содержится 15 герминальных питающих клеток и один ооцит. (Б) Иммуноокрашивание околоядерного нуажа в питающих клетках яичника, который содержит компоненты образования и действия пиРНК (включая ЛцЬ). (В) Пример однонаправленного мастер-локуса пиРНК (/1атепко), экспрессирующегося только в фолликулярных клетках яичника. (Г) Пример двухнаправленного мастер-локуса пиРНК (42АВ), экспрессирующегося только в герминальных клетках яичника. На (В) и (Г) показан характер обогащения транспозонов, и распределение плотности пиРНК на обеих цепях мастер-локусов.