Разработка подхода к созданию универсальных систем направленной доставки в опухолевые клетки на основе денримеров

• Автор: Яббаров, Никита Григорьевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 119 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Направления и пути создания противоопухолевых препаратов 14 избирательного действия

1.2. Противоопухолевые препараты направленного действия

1.2.1. Препараты на основе моноклональных антител

1.2.2. Системы пассивной (ненаправленной) доставки 18 противоопухолевых препаратов

1.3. Повышение эффективности систем доставки путем введения в их 25 состав векторных молекул
1.4. Рецептор альфа-фетопротеина как мишень для доставки 26 противоопухолевых препаратов в клетки-мишени
1.4.1. Структура альфа-фетопротеина
1.4.2. Функции и регуляция биосинтеза альфа-фетопротеина
1.4.3. Регуляция экспрессии гена альфа-фетопротеина
1.4.4. Рецепторы альфа-фетопротеина
1.5. Эпидермальный фактор роста
1.5.1. Рецептор эпидермального фактора роста
1.6. Направленная доставка биологически-активных соединений в 38 клетки-мишени с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза
1.7. Множественная лекарственная устойчивость
1.7.1. Подходы к преодолению множественной лекарственной 42 устойчивости
Заключение
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Реактивы
2.2. Оборудование

2.3. Получение рекомбинантного С-концевого домена альфа- 47 фетопротеина (rAFP3D)
2.4. Анализ rAFP3D
2.4.1. Определение концентрации rAFP3D
2.4.2. Определение концентрации тиольных групп
2.4.3. ВЭЖХ анализ рекомбинантного rAFP3D
2.5. Получение FITC-меченого rAFP3D
2.6. Получение FITC-меченных полиамидоаминовых дендримеров 51 (G2)
2.7. Потенциометрическое титрование
2.8. Синтез конъюгата rAFP3D с G2 и FITC
2.9. Синтез конъюгата G2 с доксорубицином (Dox)
2.10. Синтез конъюгата rAFP3D с G2 и Dox
2.11. Синтез конъюгатов EGF, YH и MY с G2 и Dox
2.12. Изучение кинетики высвобождения Dox из конъюгата G2-Dox
2.13. Культивирование клеток
2.14. Анализ связывания и эндоцитоза конъюгатов опухолевыми 57 клетками и лимфоцитами с помощью проточной цитометрии
2.15. Исследование внутриклеточной локализации конъюгатов с 57 помощью лазерной конфокальной микроскопии
2.16. Исследование цитотоксической активности конъюгатов
2.17. Определение уровня экспресии и аутофосфорилирования EGFR с 58 помощью проточной цитометрии
Глава 3. Результаты
3.1. Получение rAFP3D
3.2. Анализ биологической активности rAFP3D in vitro
3.3. Синтез и характеристика конъюгатов G2-FITC и rAFP3D-G2-FITC
3.4. Синтез и характеристика конъюгатов G2-Dox и rAFP3D-G2-Dox
3.5. Высвобождение Dox из конъюгата G2-Dox
3.6. Эндоцитоз и внутриклеточное распределение rAFP3D-G2-Dox и

G2-Dox
3.7. Цитотоксическая активность G2-Dox и rAFP3D-G2-Dox
3.8. Синтез и характеристика конъюгатов EGF-G2-Dox, YH-G2-Dox и 76 MY-G2-Dox
3.9. Анализ уровня EGFR (Herl) на поверхности опухолевых клеток и 78 функциональной активности EGF-G2-Dox, YH-G2-Dox и MY-G2-Dox
3.10. Эндоцитоз и внутриклеточное распределение EGF-G2-Dox, YH- 81 G2-Dox и MY-G2-Dox
3.11. Цитотоксическая активность EGF-G2-Dox, YH-G2-Dox и MY-G2- 85 Dox
Глава 4. Обсуждение результатов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

меркаптоэтанолом; возможность получения белка в препаративных количествах как из природных источников, так и в виде рекомбинантного белка с использованием генно-инженерных технологий; высокое содержание рецепторов EGF на поверхности широкого спектра опухолевых клеток [113]. Поскольку целый ряд опухолей эпителиального и мезенхимального происхождения содержит большое количество рецепторов EGF, в отличие от клеток нормальных тканей, это создает возможность избирательного транспорта препаратов в опухолевые клетки-мишени с помощью EGF.
1.5.1. Рецептор эпидермального фактора роста
Рецептор эпидермального фактора роста EGFR, известный как ErbBl/HERl, является членом ErbB семейства тирозинкиназных рецепторов, которое также включает ErbB2 (Neu, HER2), ЕгЬВЗ (PIER3) and ErbB4 (HER4) [114-117]. С EGFR специфически могут взаимодействовать такие лиганды как EGF, трансформирующий фактор роста альфа, эпиген, амфирегулин, бетацеллюлин, эпирегулин и другие, причем одним из наиболее высокоаффинных лигандов является EGF. Комплекс EGF/EGFR индуцирует рост, дифференцировку, миграцию, адгезивность, а также выживание клеток посредством регуляции множества сигнальных путей. Связывание EGF с внеклеточным доменом рецептора инициирует его димеризацию (гетеро- и гомодимеризация) и аутофосфорилирование с последующей активацией цитоплазматического тирозинкиназного домена. Активированный EGFR регулирует активность различных метаболических путей посредством взаимодействия с рядом цитоплазматических мишеней [118-120]. Большинство из таких мишеней являются белками содержащими SH2 и фосфотирозин связывающие домены. Например, один из таких адаптерных белков - GRB2, после связывания с фосфорилированым остатком тирозина 1068 EGFR, взаимодействует с SOS (пул генов кодирующих GEFs регулирующих активность ГТФаз, в том числе Ras). После этого SOS переходит в активное состояние, в котором SOS взаимодействует с RAS и