Консервативность и вариабельность ДНК ядрышковых организаторов человека

• Автор: Шибалёв, Дмитрий Валерьевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 96 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Организация, локализация и количественная оценка содержания рибосомной ДНК (рДНК) в геноме человека
1.2 Строение мономерных единиц рДНК. Орфоны
1.3 Alu повторы в геноме и в рДНК человека и их предполагаемые функции
1.4 Экспрессия и процессинг рибосомной РНК
1.5 Прителомерные и прицентромерные пространства, соседствующие с ядрышковым организатором в акроцентрических хромосомах
1.6 Специфические особенности и возможные механизмы эволюции рДНК
1.7 Сложная структура и динамическая эволюция субтеломер человека
1.8 Картирование фрагментов рибосомной РНК в хромосомах человека, лишенных ядрышковых организаторов
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Выделение ДНК из крови
2.2 Выделение ДНК из тканей
2.3 Блот-гибридизационный анализ ДНК
2.3.1 Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами
2.3.2 Электрофоретическое фракционирование фрагментов геномной ДНК
2.3.3 Перенос ДНК на нейлоновый фильтр (по Саузерну)
2.3.4 Обработка нейлоновых фильтров перед гибридизацией
2.3.5 Синтез меченых олигонуклеотидных зондов с помощью киназной реакции
2.3.6 Гибридизация ДНК на фильтрах с мечеными олигонуклеотидными зондами
2.3.7 Получение радиоавтографов
2.3.8 Щелочная отмывка фильтра
2.4 ПЦР-амплификация
2.5 Получение рекомбинантных ДНК с помощью лигазной реакции
2.6 Трансформация компетентных клеток рекомбинантной ДНК
2.7 Отбор рекомбинантных колоний методом ПЦР-амплификации
2.8 Выделение плазмидной ДНК
2.9 Обработка рекомбинантных плазмид рестрикционными эндонуклеазами
2.10 Электрофоретическое фракционирование фрагментов плазмидной ДНК
2.11 Секвенирование рекомбинантной плазмидной ДНК методом амплификации с терминаторами
2.12 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Феномен образования рекомбинантных (химерных) молекул ДНК, как следствие преждевременной терминации полимеразной цепной реакции в локусах содержащих однонаправленные Alu элементы и микросателлитные последовательности
3.2 Природа гетерогенности сегмента LR2var рМГС человека
3.3 Анализ in silico горячих точек рекомбинации, связанных с рДНК
3.4 Сегментная дупликация прилегающих к рДНК участков генома человека
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1 Феномен образования рекомбинантных (химерных) молекул ДНК, как следствие преждевременной терминации полимеразной цепной реакции в локусах содержащих однонаправленные Alu элементы
4.2 Природа гетерогенности сегмента LR2 var рМГС человека
4.3 Сегментные дупликации прилегающих к рДНК участков генома человека

выводы
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
Биогенез рибосом - координированный многостадийный процесс, происходящий в ядрышке, где синтезируется, созревает и подвергается модификациям рибосомная РНК (рРНК) которая затем входит в состав зрелых рибосомных субъединиц. Этот процесс забирает огромное количество клеточной энергии и тесно связан с ростом и делением клеток. Скорость синтеза белка строго коррелирует с содержанием в клетке рРНК и транспортной РНК (тРНК), Синтез рРНК является первым событием в синтезе рибосом, и он активно регулируется внешними сигналами, такими как тип питания, ростовые факторы и клеточные стрессы. Таким образом, транскрипция генов рРНК и созревание пре-рРНК играют центральную роль в сложной системе контроля клеточного роста и пролиферации. Клетки растут и делятся. Некоторые типы клеток растут без деления, например, нейроны и ооциты. Развивающиеся зиготы, напротив, делятся без роста. Однако для подавляющего большинства клеток процессы роста и деления тесно сопряжены, что приводит к поддержанию размера клеток в узких пределах. Для роста клеток необходим синтез белков, а для синтеза белков необходимы рибосомы. Таким образом, контроль синтеза рибосом является неотъемлемым атрибутом контроля клеточного роста [Dipayan and Warner, 2004].
Гены, которые кодируют нуклеиновые кислоты и белки, формирующие рибосомы, а также гены, обслуживающие созревание транскриптов, активацию зрелых продуктов и функционирование рибосом, образуют массивный полигенный комплекс, и их координированная работа жизненно необходима для поддержания жизни отдельных клеток и всего организма в целом. Механизмы репликации и транскрипции рДНК, а также механизмы поддержания ее константности или вариабельности, поняты далеко не в полной мере. Они изучаются в ряде лабораторий во всем мире в совокупности с сопутствующими проблемами [Jacob, 1995; Gonzalez and Sylvester, 1995, 1997, 2001; Gonzalez et al., 1989; Grummt, 2003; Grummt, 1999; Langst et al., 1997; Mayer et al., 2005; Nosikov and Braga, 1982; Kupriyanova, 2000].
Давно известно, что количественные и качественные изменения в синтезе рРНК могут быть важными молекулярными показателями состояния организма. Это касается, в частности, возрастных изменений числа генов рРНК и характера метилирования рДНК. В ряде работ показано возрастное снижение количества рДНК в тканях мозга и сердца человека и в тканях мыши методом Саузерн гибридизации [Johnson and Strehler, 1972; Gaubatz and Cutler, 1978].
Исследование связи между метилированием рДНК и экспрессией рРНК при старении на культурах клеток, полученных от больных с синдромом Вернера, показало, что эти

высыхания.. Клетки подращивали в течение 16 часов при 37 °С до образования отдельных колоний.
Отбор осуществлялся на основании «сине-белого теста»: для дальнейшего анализа отбирали неокрашенные колонии клеток, несущие рекомбинантную плазмиду.
2.7 Отбор рекомбинантных колоний методом ПЦР-амплификации К обратной стороне чашки с LB-агаром и ампицилином приклеивали заранее разлинованный и обозначенный цифрами лист бумаг и. В соответствии с этими номерами на LB-arap стерильными наконечники «перекалывали» колонии клеток, содержащие рекомбинантную плазмиду. Инкубацию осуществляли в течение ночи при 37°С.
Для анализа полученных колоний в пробирки добавляли 50 мкл воды milli Q и стерильными наконечниками переносили часть колонии с чашки. Затем на 10 минут помещали пробирки на кипящую водяную баню, где происходил лизис бактериальных клеток и высвобождение плазмиды. Полученную смесь центрифугировали, отбирали 5мкл супернатанта и использовали его в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции с праймерами, которые использовались для получения ПЦР-продукта, используемого для лигирования и трансформации.
2.8 Выделение плазмидной ДНК
Отдельную колонию E. Coli, содержащую рекомбинантную плазмиду, высевали в 10 мл LB среды и инкубировали на качалке при 200 об/мин и 37° С в течение ночи. Затем культуру клеток центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин. Осадок клеток суспендировали в 300 мкл воды. Суспензию клеток охлаждали в ледяной бане (0°С). Затем к суспензии добавляли 450 лизирующего буфера №2 следующего состава: 1% SDS, 0.2 N NaOH. Смесь инкубировали в ледяной бане в течение 5 минут. Выравнивали уровень pH добавлением 600 мкл 3 М раствора ацетата калия (pH 5.0). Содержимое клетки осаждали центрифугированием при 14000 об/мин в течение 20 минут. Супернатант переносили в новые пробирки и добавляли равный объем охлажденного изопропанола (-20°С). Центрифугировали при 14000 об/мин в течение 20 минут, супернатант сливали, осадок промывали раствором 75% этанола, высушивали при 37° С, растворяли в 150 мкл воды. Затем добавляли 300 мкл 7.5 М NH4AC и инкубировали при -20° С 30-40 минут. Далее смесь центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10-15 минут, переносили супернатант в новые пробирки и добавляли 2V сильно охлажденного 96% этанола и повторяли центрифугирование с охлаждением при 14000 об/мин в течение 10-15 минут. Супернатант сливали, а осадок промывали 75% раствором этанола, высушивали при 60° С, растворяли в 30 мкл воды. Затем добавляли РНКазу до концентрации 50-100 мкг/мл. Смесь инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 1 часа. После инкубации в смесь добавляли воду до 200 мкл и 4M раствор ацетата