Олигонуклеотидные ингибиторы ДНК-метилтрансферазы 1 человека и их влияние на аберрантное гиперметилирование ДНК в раковых клетках

• Автор: Кузнецов, Виталий Викторович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 131 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

1.1.1. ДНК-метилтрансфераза

1.1.2. Семейство ДНК-метилтрансфераз

1.2. БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК У МЛЕКОПИТАЮЩИХ

1.3. СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ СИСТЕМЫ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК

1.3.1. Методы, основанные на применении 5-метилцитозин-специфичных антител

1.3.2. Методы, основанные на бисульфитной конверсии ДНК

1.3.3. Методы, основанные на применении метилчувствительных и метилзависимых эндонуклеаз рестрикции

1.4. ДЕМЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК

1.5. ИНГИБИРОВАНИЕ МТаз
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.1.1. Олигодезоксирибонуклеотидные ингибиторы ОптИ
2.1.2. Клеточные линии
2.1.3. Праймеры и ТацМап-зонды
2.2. МЕТОДЫ
2.2.1. Измерение скоростей реакции метилирования ДНК
2.2.2. Изучение внутриклеточной локализации олигонуклеотидов в клетках
2.2.3. Исследование цитотоксичности и ингибирующей активности олигонуклеотидных ингибиторов ОптИ
2.2.4. Выделение ДНК из клеток
2.2.5. ОЕАО-ПЦР анализ статуса метилирования ДНК
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Дизайн олигонуклеотидов, специфичных к Опт!
3.2. Субстратные свойства синтетических олигонуклеотидных структур
3.3. Ингибиторные свойства олигонуклеотидных структур в отношении активности ОптИ
3.4. Локализация олигонуклеотидных ингибиторов ОптИ в клетках карцином шейки матки
3.5. Оценка цитотоксичности олигонуклеотидных ингибиторов ОптН
3.6. Адаптация метода СЬАО-ПЦР для анализа статуса метилирования ДНК
3.7. Оценка деметилирующего эффекта ингибиторов на гиперметилированные регуляторные районы генов-супрессоров опухолей
3.8. Заключение
4. ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Несмотря на то, что все клетки человеческого организма несут одинаковую генетическую информацию, в ходе клеточной дифференцировки формируется более 100 различных цитотипов. Основная роль в этом процессе принадлежит системе метилирования ДНК, регулирующей транскрипционную активность генов.
Профиль метилирования ДНК эукариот поддерживается ферментом ДНК-метплтрансферазой I (МТазой Dnmtl), которая обеспечивает модификацию вновь синтезированной цепи ДНК при ее репликации. Известно, что метилирование ДНК является ключевым эпигенетическим механизмом, контролирующим не только экспрессию генов (Lande-Diner et al. 2007, Miranda and Jones 2007), но и родительский импринтинг (Ноге et al. 2007, Sha 2008), инактивацию Х-хромосомы (Straub and Becker 2007, Yen et al. 2007), поддержание целостности генома клетки и его защиту от встраивания ретровирусов и транспозонов (Yoder et al. 1997, Howard et al. 2008). Аберрантное метилирование ДНК может способствовать развитию неврологических, психических, эндокринных заболеваний (болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, аутизм, шизофрения, сахарный диабет II типа и др.) (Robertson 2005, Feinberg 2007), а также возникновению и прогрессии опухолей (рак молочной железы, яичников, шейки матки и др.) (Feinberg and Tycko 2004, Jones and Baylin 2007).
Сбои в работе Dnmtl обусловливают масштабные изменения паттерна метилирования ДНК, включающие гиперметилирование CpG-островков (последовательностей, содержащих кластеры CpG-динуклеотидов) в составе генных промоторов или первых экзонов. Избыточное метилирование регуляторных областей, сопровождающееся подавлением транскрипции генов, рассматривается в настоящее время как альтернативный механизм (наряду с мутациями) инактивации большой группы генов-супрессоров опухолевого роста, инвазии, метастазирования, неоангиогенеза, в том числе генов системы репарации

независимой реакции (Herman et al. 1996). Эта вторая реакция направлена на то, чтобы отличить цитозин .' (метилцитозин исходной ДНК) от- тимина (неметилированного цитозина исходной ДНК). При использовании соответствующих стандартов практически любой из нижеперечисленных методов можно превратить в количественный, однако чувствительность к малым количествам метилированной ДНК у них существенно отличается.
В качестве второй реакции может выступать секвенирование предварительно клонированных фрагментов с терминирующими дидезоксирибонуклеотидами (метод Сэнгера), позволяющее проанализировать статус метилирования всей амплифицированной области ДНК (Frommer et al. 1992). Данный метод привлекает объемом получаемых данных, но получение достоверных результатов возможно только при условии, что метилированные последовательности ДНК составляют не менее 20 % от общего числа копий и при анализе не менее десяти клонов (Shen and Qin 2012). Применение пиросеквенирования позволяет определять метилцитозин при наличии 5 % метилированной ДНК (White et al. 2006), в то время как при помощи NGS можно проанализировать метилирование всех цитозиновых оснований в геноме за короткое время.
Конверсия цитозина в тимин в процессе обработки бисульфитом натрия приводит к изменению температур плавления ПЦР-продуктов. На таком принципе базируется метод MS-MCA (Methylation-Sensitive Melting Curve Analysis) и его усовершенствованная версия MS-HRM (Methylation-Sensitive High-Resolution Melting). Так, исходно метилированная ДНК будет иметь более высокую температуру плавления из-за большего содержания GC-динуклеотидов. Это может учитываться при анализе кривых плавления ампликонов в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I (Worm et al. 2001). Флуоресценция SYBR Green I будет угасать в процессе нагревания образца по мере диссоциации двуцепочечной ДНК, таким образом, GC-богатая ДНК будет флуоресцировать дольше. Предел определения для данного метода составляет около 5 % метилированной ДНК в образце (Kristensen and Hansen 2009). Однако применение