Транскрипционная регуляция кластеров семенник-специфичных генов Stellate y Drosophila melanogaster

• Автор: Оленкина, Оксана Михайловна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 147 с. : ил.

Содержание
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1 Актуальность проблемы
1.2 Цели и задачи работы
1.3 Научная новизна работы
1.4 Практическая значимость
1.5 Апробация работы
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 РОЛЬ ГЕНОВ STELLATE В СПЕРМАТОГЕНЕЗЕ DROSOPHILA MELANOGASTER
2.1.1 Система генов crystal-Stellate
2.1.2 Эволюция системы генов crystal-Stellate
2.1.3 Гены Stellate — основная мишень ріРНК-зависимого сайленсинга в герминальных тканях самцов Drosophila melanogaster
2.1.4 Белок Stellate, партнёры и посттрансляционные модификации
2.2 ТРАНСКРИПЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ У ЭУКАРИОТ
2.2.1 Области контроля транскрипции. Белки регуляторы транскрипции

2.2.2 Способы инициации транскрипции
2.2.3 Основные регуляторные элементы корового промотора
2.2.3.1 ТАТА-бокс
2.2.3.2 TFIIB recognition element (BRE). BREu и BREd
2.2.3.3. Инициатор (Inr)
2.2.3.4 Downstream Promoter Element (DPE)
2.2.3.5 Motif ten element (MTE)
2.2.3.6 Трехчастная организация послестартового корового промотора DCP (downstream core promoter)
2.2.3.7 Downstream core element (DCE)
2.2.3.8 Элементы, функционирующие независимо от ТАТА-бокса или инициатора (ХСРЕ1, ХСРЕ2, MED-1)
2.2.3.9 ТСТмотив (полипиримидиновый инициатор)
2.2.3.10 CpG островки
2.2.4 Проксимальные промоторные элементы
Е-бокс (enhancer box). Суперсемейство транскрипционных факторов bHLH
2.2.5 Дистальные регуляторные элементы
2.2.6 Модели транскрипционной регуляции с помощью регуляторных элементов минимального промотора
2.2.7 Семенник-специфичные промоторы Drosophila
2.2.8 Особенности транскрипции генов при сперматогенезе у Drosophila
Заключение
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Биоинформатические методы
3.1.1 Поиск участков связывания транскрипционных факторов
3.1.2 Оценка дивергенции промоторов
3.2 Биологические материалы
3.3 Линии Drosophila и генетические скрещивания
Мобилизация P-элементов Stel34-lacZ и Stel34-E2M-lacZ
3.4 Стандартные молекулярно-биологические методы

3.5 Создание трансгенных конструкций Stel34-E123lif-lacZ и Stel34-E2?'-lacZ
3.6 Трансформация эмбрионов Drosophila
3.6.1 Подготовка и тренировка стада
3.6.2 Сбор эмбрионов и инъекции
3.6.3 Сбор эмбрионов после инъекций
3.7 Анализ активности р-галактозидазы в семенниках трансгенных мух
3.8 Выделение ядерных экстрактов
3.9 Гель-шифт
3.9.1 Зонды
3.9.2 Получение двуцепочечных зондов
3.9.3 Копирование и очистка зондов
3.9.4 Гель-шифт и супер-шифт
3.10 Детекция транскриптов dUSF
3.11 Получение антител к белку dUSF
3.11.1 Создание конструкций pQE30 —fUSF и pQE30 -tUSF
3.11.2 Экспрессия конструкций pQE30 -fUSF и pQE30 -tUSF и очистка рекомбинантных белков
3.11.3 Иммунизация мышей рекомбинантными белками 6His-fUSF и 6His-tUSF и получение антисывороток
3.12 Иммуноферментный сорбционный анализ (ELISA)
3.13 Электрофорез в денатурирующих условиях в ДСН-ПААГ и Вестерн-блот-анализ
3.14 Иммунофлуорссцентное окрашивание препаратов целых семенников и конфокальная микроскопия
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1 Идентификация дме-регуляторных участков в промоторе генов Stellate
4.2 Идентификация фактора, связывающего Е-боксы в промоторе гетерохроматиновых генов Stellate
4.3 Оценка значимости цме-регуляторных элементов в составе промотора
гетерохроматиновых генов Stellate in vivo

которой характерно наличие множественных слабых сайтов старта транскрипции в широкой области протяженностью от 50 до 100 нуклеотидов (рисунок 9) (Caminci et al., 2005; Caminci et al., 2006; Juven-Gershon et al., 2006).
Некоторые промоторы обладают чертами как фокусных, так и дисперсных промоторов. Например, промотор может иметь множественные сайты старта транскрипции в широкой области, но с одним особенно сильным TSS (Juven-Gershon and Kadonaga, 2010). Фокусные промоторы часто содержат ТАТА-бокс (Juven-Gershon et al., 2008b) и являются наиболее древним типом промоторов, консервативным от архей до позвоночных. Для дисперсных промоторов характерна сверхпредставленность CpG-островков. Большинство генов высших эукариот находятся под контролем дисперсных промоторов. У позвоночных до 70% генов имеют дисперсные промоторы. В принципе считается, что фокусные промоторы есть у генов с регулируемой экспрессией (индуцируемых), тогда как дисперсные промоторы в основном используется генами с конститутивной экспрессией, т. н. генами «домашнего хозяйства» (рисунок 9).
Фокусная транскрипция
Регулируемые гены
г* г* г* г* г*
Дисперсная транскрипция Гены "домашнего хозяйства"
Рисунок 9. Фокусный и дисперсный способ инициации транскрипции (из K.adonaga, 2012).
Большинство исследований механизмов транскрипции РНК-полимеразой II были выполнены на фокусных промоторах. Хотя доля фокусных промоторов у позвоночных невелика, на исследования фокусных промоторов были затрачены большие усилия по сравнению с дисперсными промоторами, что объясняются биологической значимостью регулируемых генов, с которыми ассоциированы фокусные промоторы.
Исследования фокусных промоторов привело к открытию таких регуляторных мотивов как ТАТА-бокс, BREu (г/pstream TFILB recognition element), Inr (initiator), MTE (motif ten