ДНК-аптамеры, специфичные к фибриллярной форме белка Sup35p дрожжей Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Сурина, Елизавета Рафаэлевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

Оглавление
Введение

Список сокращений и обозначений

Обзор литературы

Часть I. Прионы

Прионная концепция

Прионные болезни человека

Прионы других организмов

Функции белка Бир35р

Биохимические свойства белка Бир35р

Свойства белка №е2р

Фибриллы, образованные белками Бир35р и иге2р
Прионы дрожжей: общие черты
Другие прионы дрожжей. Поиск новых белков с прионными свойствами.
Две модели прионной конверсии
Роль Нзр104р и других белков в образовании [Р57+]
Штаммы прионов
Межвидовые барьеры
Надфибриллярные структуры. Структура прионных полимеров
Значение прионов
Строение белка Ргр. Подходы к диагностике и лечению прионных
болезней
Часть II. ЪЕЬЕХ
История БЕБЕХ
Методология БЕЬЕХ
Библиотека олигонуклеотидов
Стадия связывания
Стадия разделения
Стадия амплификации
Мониторинг
Обработка аптамеров
Структура аптамеров
Преимущества аптамеров перед антителами
Вариации SELEX и модификации аптамеров
Применение аптамеров
Часть III. Аптамеры к прионным и амилоидным белкам
Заключение к обзору литературы
Материалы и методы
Материалы
Штаммы
Питательные среды
Условия культивирования
Олигонуклеотиды (СИНТОЛ)
Буферные растворы:
Реактивы:
Компьютерные программы:
Генно-инженерные методы
Работа с белками
Электроблоттинг
Осаждение растворенных белков
Электронная микроскопия
Полимеразная цепная реакция
Радиоактивное мечение ДНК
ИФА-подобная методика определения эффективности связывания с
мишенью ДНК-аптамеров, содержащих 5’-биотин
Определение констант диссоциации комплексов [аптамер-мишень]
Выделение белковых агрегатов, нерастворимых в детергентах, из клеток
дрожжей Saccharomyces cerevisiae
Разделение белков в полуденатурирующих условиях в агарозном геле
(SDD-AGE)

Дот-блот и специфическое окрашивание аптамерами белков на
нитроцеллюлозных мембранах
Результаты
1. Получение рекомбинантного фрагмента NM белка Sup35p дрожжей
Saccharomyces cerevisiae
1.1. Выделение и хроматографическая очистка белка Sup35NM из клеток E.coli.
1.2. Изучение свойств рекомбинантного белка Sup35NM
2. Полимеризация рекомбинантного белка Sup35NM in vitro
2.1. Дискриминация фибрилл и мономеров
2.2. Подбор буферных условий
2.3. Подбор условий центрифугирования
2.4. Подбор температурных режимов полимеризации
2.5. Оценка влияния ультразвука на размер полимеров Sup35NM
2.6. Влияние инкубации при отрицательной температуре на седиментацию фибрилл
2.7. Препаративная наработка фибрилл Sup35NM, характеристика полученного образца
2.8. Электронное микроскопирование полимеров белка Sup35NM, выделенного из клеток E.coli
3. Получение аптамеров к фибриллярной форме рекомбинантного белка Sup35NM
3.1. Выбор нуклеотидной последовательности исходного ДНК-материала для SELEX
3.2. Проведение SELEX
3.3. Клонирование и секвенирование двухцепочечных копий ДНК-аптамеров по окончании SELEX
3.4. Обработка нуклеотидных последовательностей аптамеров: поиск гомологий
3.5. Выбор последовательностей для индивидуального синтеза
3.6. Оптимизация последовательностей аптамеров
4. Описание аптамеров с помощью ИФА-подобной методики, определение Kd. Формирование окончательной выборки аптамеров
Гораздо более привычным с точки зрения поиска лекарства является испытание различных химических веществ на модельной системе. В данном случае дрожжи служат таковой; более 2500 химических соединений было испытано на предмет их способности элиминировать [Р5/+]. В результате было выявлено шесть веществ, способных подавлять [■РЛ7+]-фснотап. Пять из этих веществ принадлежали к новому классу соединений -кастеллпаолитинов, а шестое оказалось фенантридином. Все эти вещества «вылечивали» также [URE3] в клетках дрожжей, а также подавляли конверсию PrPc-> PrPSc в культурах клеток нейробластомы мыши [15]. Интересно, что два других вещества, антиприонное действие которых было показано для культур клеток млекопитающих, а именно хинакрин (лекарство против малярии), и хлорпромазин (антипсихотическое средство), подавляют [PSIr] и [UНЕ3j-детерминанты в клетках дрожжей; на основе этих результатов можно предположить, что механизмы, поддерживающие прионное состояние белков в клетках млекопитающих и дрожжей, имеют много общих черт. Все поименованные вещества действуют только на делящиеся клетки; для излечения от приона требуется несколько поколений. Это означает, что все они влияют на стабильность наследования прионного состояния, но не затрагивают сформированные белковые агрегаты [123].
Таким образом, несмотря на заметные успехи и в области диагностики, и в области поиска лекарства против прионных заболеваний, многие задачи остаются нерешёнными. Среди важных следует отметить направление поиска средства ранней диагностики прионных болезней, а также поиск веществ, способствующих растворению сформированных прионных агрегатов.
Часть IL SELEX
Аптамеры получают при помощи процедуры SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment); материалом служит смесь олигонуклеотидов с частично случайной последовательностью, которую подвергают циклически повторяющимся стадиям связывания с избранной мишенью, разделения и амплификации связавшихся с мишенью молекул нуклеиновой кислоты (см. рис. 1).