Стимуляция активности опухолевого супрессора p53 протимозином альфа

• Автор: Захарова, Наталья Ильинична
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 121 с. : ил.

Содержание
Список условных обозначений
Введение
1. Протимозин альфа и гистон Н1. Их взаимодействие и роль в регуляции р53-зависи’мой транскрипции (обзор литературы)
1.1. Протимозин альфа
1.1.1. Структура протимозина альфа
1.1.2. Внутриклеточная локализация протимозина альфа
1.1.3. Протимозин альфа и клеточное деление
1.1.4. Протимозин альфа и апоптоз
1.1.5. Протимозин альфа как переключатель некроза на апоптоз
1.1.6. Протимозин альфа и опухолевая трансформация
1.1.7. Данные о влиянии протимозина альфа на экспрессию генов
1.2. Опухолевый супрессор р53
1.2.1. Структура р53
1.2.2.' Регуляция уровня и активности р53 в клетке
1.2.3. Субклеточная локализация р53. Роль посттрансляционных модификаций во внутриклеточном транспорте р53
1.2.4. Особенности регуляции активности р53 в клетках НеЬа
1.3. Гистон Н1
1.3.1. Гистон Н1. Структура и функции
1.3.2. Гистон Н1 специфически регулирует транскрипцию
1.3.3. ГистонН1ир53
1.3.4. Гистон Н1 и протимозин альфа
2. Материалы и методы
2.1. Реактивы и материалы
2.2. Общие методы
2.3. Манипуляции с плазмидпой ДНК
2.4. Конструирование плазмид
2.5. Манипуляции с клетками млекопитающих
2.6. Получение стабильной клеточной линии с пониженным уровнем протимозина
альфа

2.7. Получение стабильной клеточной линии с повышенным уровнем протимозина
альфа
2.8. Исследование взаимодействия гистона Н1, р53 и протимозина альфа
2.9. Иммунопреципитация хроматина (СЫР)
2.10. Определение уровня представленности транскриптов
2.11. ПЦР в реальном времени
3. Стимуляция активности опухолевого супрессора р53 протимозином альфа (результаты
и их обсуждение)
3.1. Влияние уровня протимозина альфа на транскрипционную активность
опухолевого супрессора р53
3.2. Исследование механизма стабилизации и активации опухолевого супрессора
р53 протимозином альфа
3.3. Локализация структурных детерминант протимозина альфа, ответственных за
активацию р53
3.4. Роль гистона Н1 в регуляции активности р53 протимозином альфа
3.5. Экспрессия тирозиновой протеинкиназы 1АК1 зависит от уровня
протимозина альфа в клетках НеЬа
Выводы
Список литературы
Благодарности

Список условных обозначений
ARE - участок ДНК, регулирующий индуцируемые при окислительном стрессе гены ВРВ - бромфсноловый синий
СВР (CREB-binding protein) - коактиватор транскрипции ChIP - иммунопреципитация хроматина
CREB - белковый фактор, связывающийся с CRE (cAMP Response Element)
DMEM - (Dulbecco's Modified Eagle Medium) культуральная среда dNTP - смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов dox - доксорубицин
EBNA3C - ядерный антиген ЗС вируса Эпштейна-Барр
FBS - бычья эмбриональная сыворотка
GAPDH - глицеральдегид-З’-фосфат-дегидрогеназа
(E)GFP - зеленый флуоресцирующий белок
GST - глутатион-Б-трансфераза
HAT - гистоновые ацетилтрансферазы
HEPES - Ь1-2-гидроксиэтилпиперазин-1М’-этансульфоновая кислота
HPV - вирус папилломы человека
Klenow - фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E.coli
hic - ген люциферазы светлячков
NES - сигнал экспорта из ядра
NLS - сигнал ядерной локализации
PMSF - фенил-метилсульфонат-фторид
siRNA - короткая интерферирующая РНК
shRNA - короткая шпилечная РНК
STAT - (Signal Transducer and Activator of Transcription) фактор транскрипции
X-Gal - 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-Р-В-галактопиранозид
БСА - бычий сывороточный альбумин
ДСН - додецилсульфат натрия
ИПТГ - изопропшх-р-О-тиогалактозид
ПААТ - полиакриламидный гель
ПроТа - протимозин альфа
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЭГ - полиэтиленгликоль

1.3. Гистон HI
1.3.1. Гистон HI. Структура и функции
Гистоны относятся к крупному классу белков, обладающих общей функцией компактизации ДНК в ограниченном пространстве ядра в виде высокоорганизованной структуры хроматина. Элементарной структурной единицей эукариотического хроматина является нуклеосома, состоящая из фрагмента ДНК длиной 146 пар оснований, накрученного на октамер так называемых «коровых» гистонов (Н2А, Н2В, НЗ и Н4) [127-129]. Кроме того, в организацию нуклеосомной последовательности вовлечены линкерные гистоны Н1/Н5, которые ассоциированы с небольшим фрагментом неупакованной в нуклеосомы ДНК (линкерной ДНК).
Гистоны - это относительно небольшие белки (110-220 ак) с очень большой долей положительно заряженных аминокислотных остатков (лизина и аргинина), что помогает этим белкам крепко связываться с ДНК независимо от ее нуклеотидной последовательности. Как и ПроТа, гистоны - мультикопийные белки (порядка 107 молекул на клетку)..
В клетках млекопитающих обнаружено как минимум 8 типов гистона Н1, включая субтипы от Н1.1 до Н1.5, а также специфичный для соматических клеток — Н1о, для зародышевых клеток — Hit и Hloo. Каждый из субтипов гистона Н1 состоит из центрального глобулярного домена и ДНК-связывающих С-концевого и N-концевого доменов. В частности,
для изоформы гистона Н1.2 центральный домен представлен ак 35-109, С-концевой — ак

213 и N-концевой домен — ак 1-34. Центральный домен является глобулярным и образует структуру «крылатой» спирали, тогда как N- и С-концевые домены в растворе не имеют определенной структуры. Оба терминальных домена приобретают некую вторичную структуру при взаимодействии с ДНК. Терминальные домены эволюционировали отлично от глобулярных. Последние эволюционно гораздо более стабильны и видоизменялись в основном только путем замены нуклеотидов. Терминальные домены, в целом более вариабельные, видоизменялись помимо замен вставками и делениями нуклеотидов [130, 131, 132]. Существование нескольких субтипов Н1 и различия в их аминокислотных последовательностях говорят о том, что разные субтипы гистона Н1 могут иметь различные функции. Об этом свидетельствует также то, что экспрессия каждого Н1-субтипа зависит от вида ткани, стадии клеточного цикла и стадии дифференцировки [130, 131, 133].
1.3.2. Гистон Н1 специфически регулирует транскрипцию
Модификации гистонов - основной механизм эпигенетического контроля экспрессии генов. Роль коровых гистонов в регуляции экспрессии генов широко изучается, тогда как