Изучение функционирования склонной к ошибкам ДНК-полимеразы йота в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека и мыши

• Автор: Лахин, Андрей Васильевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил.

Содержание

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Повреждения ДНК и их последствия

2.1.1. Типы повреждений ДНК

2.1.2. Система репарации ДНК

2.2. ДНК-полимеразы, принимающие участие в синтезе через повреждение (TLS-ДНК-полимеразы)

2.2.1. Специфичность TLS-ДНК-полимераз к различным повреждениям и модификациям ДНК

2.2.2. Регуляция активности TLS-ДНК-полимераз

2.3. Свойства и функции ДНК-полимеразы йота (Pol i) млекопитающих

2.3.1. Биохимические свойства Pol i in vitro
2.3.2. Регуляция активности Pol i в клетках млекопитающих
2.3.3. Активность Pol i в экстрактах клеток
2.3.4. Мп2+ как основной активирующий кофактор Pol i
2.3.5. Предполагаемые функции Pol i в клетке
2.4. Аптамеры как перспективное средство терапии и диагностики нового поколения—
2.4.1. Принципы получения аптамеров
2.4.2. Области применения аптамеров
2.4.3. Ограничения использования аптамеров и пути их преодоления
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Список использованных ферментов, растворов и сред
3.2. Животные и клеточные линии
3.3. Приготовление экстрактов клеток для проведения ДНК-полимеразной реакции
3.4. Получение субстрата для проведения ДНК-полимеразной реакции
3.5. Реакция элонгации радиоактивно меченого праймера
3.6. Электрофорез продуктов ДНК-полимеразной реакции в денатурирующем полиакриламидном геле
3.7. Процедура SELEX
3.8. ПЦР олигонуклеотидов библиотеки и анализ продуктов синтеза
3.9. Определение аффинности селектированных пулов олигорибонуклеотидов

ЗЛО. Получение компетентных клеток Е. coli и их трансформация
3.11. Выделение плазмидной ДНК
3.12. Приготовление аптамеров для анализа in vitro
3.13. Анализ SSCP индивидуальных РНК-антамеров
3.14. Определение Kd и IC50 РНК-аптамеров
3.15. Изучение ингибирующего действия аптамера IKL5 на активность Pol i r экстрактах клеток
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Получение РНК-аптамеров к Pol i
4.2. Ингибирование ДНК-полимеразной активности гомогенного препарата
Pol i аптамером IKL
4.3. Влияние аптамера IKL5 на интенсивность образования продуктов с некорректно встроенным G напротив Т матрицы в экстрактах нормальных
и опухолевых клеток человека
4.4. Роль двухвалентных катионов металлов в функционировании всего комплекса ДНК-полимераз в экстрактах клеток
4.5. Влияние двухвалентных катионов металлов на ошибочность синтеза ДНК-—
4.6. Изменения в Мп-индуцированпой некорректной активности Pol i в экстрактах клеток под воздействием двухвалентных катионов металлов
4.7. Влияние концентрации Мп2+ на активность Pol i в экстрактах различных
типов клеток человека и мыши
4.8. Изменения в Mn-зависимом синтезе ДНК, происходящие при
злокачественной трансформации клетки
5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
А - аденозин
G - гуанозин
Т - тимидин
U - уридин
С - цитозин
8-oxoG - 8-оксогуанин
BER - эксцизионная репарация оснований
dNMP - дезоксинуклеотидмонофосфат
dNTP - дезоксинуклеотидтрифосфат
HIF1 - индуцируемый гипоксией фактор
NER - эксцизионная репарация нуклеотидов
MisGvA — Некомплиментарное встраивание G напротив Т матрицы
PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток
Рої - ДНК-полимераза
RFC - репликативный фактор С
RPA - репликативный белок А
TLS - синтез ДНК через повреждение
ЦВМ - убиквитинсвязывающий мотив
АП-сайты - апурин-апиримидиновые сайты
АФК - активные формы кислорода
миРНК - малые интерферирующие РНК
ПНК - полинуклеотидкиназа
ПСА - персульфат аммония
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ОТ-ПЦР - ПЦР с обратной транскрипцией
УФ - ультрафиолет

значительно большего уровня структурного разнообразия, хотя их применение и сопряжено с определенными трудностями (большая восприимчивость молекул РНК к деградации) [171, 172].
Классическая процедура получения аптамеров, получившая название SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment), условно состоит из двух чередующихся этапов (Рис. 5).

Рис. 5. Схема процедуры отбора аптамеров SELEX. (а) Получение ИОП в ходе либо транскрипции in vitro (РНК-SELEX), либо ПЦР (ДНК-SELEX), (б) Инкубация пула олигонуклеотидов с молекулой-мишенью. (в) Удаление ие связавшихся олигонуклеотидов, (г) Отделение связавшихся олигонуклеотидов от молекулы-мишени (д) Амплификация элюированных олигонуклеотидов в ходе ПЦР или ОТ-ПЦР. (е) Инкубация обогащенного пула с молекулой-мишенью, (ж) Клонирование аптамеров, полученных после проведения 5-15 раундов SELEX.
Первый этап заключается в амплификации имеющихся олигонуклеотидов до нужной концентрации. В случае отбора РНК-аптамеров, пул одноцепочечных олигорибонуклеотидов получают в результате транскрипции in vitro двухцепочечной ДНК с использованием Т7-РНК-полимеразы. В случае отбора ДНК-аптамеров, пул одноцепочечных олигодезоксирибонуклеотидов получают разделением цепей двухцепочечных продуктов ПЦР. На втором этапе амплифицированный пул инкубируется с