Использование С-концевого домена альфа-фетопротеина для адресной доставки противоопухолевых препаратов

• Автор: Годованный, Артем Витальевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 149 с. : ил.

Содержание.
Содержание
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Введение. Проблемы современной химиотерапии опухолей и способы их преодоления
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Рецепторо-опосредованный транспорт противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки с помощью белковых векторных молекул
1.1.1. Преимущества и недостатки использования систем направленного транспорта.

1.1.2. Конъюгаты противоопухолевых препаратов с векторными молекулами
1.2. Конъюгаты векторных молекул с наночастицами на основе биодеградируемых полимеров с включенными в их состав противоопухолевыми препаратами
1.2.1. Способы получения и свойства наночастиц на основе сополимера молочной и
гликолевой кислот
1.2.2. Преимущества и недостатки использования биодеградируемых наночастиц.

1.2.3. Способы получения конъюгатов наночастиц с векторными молекулами
1.2.4. Влияние размера наночастиц на их биологические свойства
1.2.5. Преимущества наночастиц, конъюгированных с векторными молекулами
1.3.1. Функции АФП
1.3.2. Строение альфа-фетопротеина
1.3.3. Биосинтез и регуляция АФП
1.3.4. Ген АФП: регуляторный район
1.3.5. АФП и клетки опухолей
1.3.6. Рецепторы АФП
1.3.7. С-концевой домен АФП и его использование в качестве векторного белка
1.4, Использованные противоопухолевые препараты
1.4.1. Цисплатин
1.4.2. Паклитаксел и доцетаксел
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Выделение и очистка рАФПЗд
2.1.1. Плазмидный вектор, экспрессирующий С-концевой домен АФП человека
2.1.2. Получение штамма продуцента и оптимизация условий экспрессии рАФПЗд
2.1.3. Отмывка телец включения
2.1.4. Солюбилизация телец включения
2.1.5. Рефолдинг С-концевого рекомбинантного домена АФП
2.1.6. Концентрирование раствора после рефолдинга
2.2. Анализ выделенного рекомбинантного С-концевого домена АФП
2.2.1. Анализ взаимодействия рАФПЗд с рецептором in vitro
2.2.2. Исследование специфичности связывания рАФПЗд с рецептором АФП
2.3. Использование рекомбинантного С-концевого домена АФП в качестве векторной молекулы
2.3.1. Синтез конъюгата рАФПЗд с цис-дихлордиаминплатиной (цис-платином)
2.3.2. Исследование цитотоксической активности конъюгата рАФПЗд с цисплатином
2.4. Получение полимерных наночастиц с включением паклитаксела и доцетаксела
2.4.1. Разработка и оптимизация метода включения паклитаксела методом простых эмульсий
2.4.2. Подбор параметров процесса получения наночастиц
2.4.4. Получение наночастиц с введенной флуоресцетной меткой
2.5. Разработка метода связывания наночастиц с рекомбинантным С-концевым фрагментом АФП человека
2.5.2. Ковалентное связывание белка с поверхностью НЧ
2.5.3. Включение паклитаксела, доцетаксела и доксорубицина в состав полимерных НЧ с использованием модифицированного ПВС
2.5.4. Изучение кинетики высвобождения паклитаксела, доцетаксела и доксорубицина из состава НЧ
2.5.5. Получение НЧ, конъюгированных с рАФПЗд
2.6.1. Исследование специфичности и уровня связывания наночастиц с рецептором АФП на поверхности клеток аденокарциномы молочной железы линии MCF

2.6.2. Исследование эндоцитоза наночастиц, связанных с рАФПЗд, клетками аденокарциномы молочной железы человека линии MCF
2.6.3. Распределение наночастиц и лекарственного препарата внутри опухолевых клеток
2.7. Исследование цитотоксической активности наночастиц, связанных с рАФПЗд
2.7.1. Исследование цитотоксической активности наночастиц с включением паклитаксела, связанных с рАФПЗд, для опухолевых клеток
2.7.2. Исследование цитотоксической активности наночастиц с включением доцетаксела, конъюгированных с рАФПЗд, для опухолевых клеток
2.7.3. Исследование накопления и токсичности наночастиц, связанных с векторным белком, для лимфоцитов
Заключение
3. Экспериментальная часть
3.1. Реактивы и оборудование
3.1.1. Реактивы
3.1.2. Оборудование
3.2. Выделение и очистка рекомбинантного С-концевого домена АФП
3.2.1. Плазмидный вектор, экспрессирующий С-концевой домен АФП человека
3.2.2. Трансформация компетентных клеток соответствующим экспрессионным конструктом*
3.2.3. Получение штамма-продуцента
3.2.4. Оптимизация условий экспрессии
3.2.5. Ступенчатая отмывка телец включения
3.2.6. Солюбилизация телец включения и рефолдинг
3.2.7. Концентрирование раствора после рефолдинга
3.3. Анализ рАФПЗд
3.3.1. Определение концентрации белка микрометодом с использованием набора для определения белка «ВСА»
3.3.2. Электрофорез в полиакриламидном геле
3.3.3. ВЭЖХ анализ
3.3.4. Получение рекомбинантного С-концевого домена АФП, меченого изотиоцианатом флуоресцеина (ФИТЦ)
79), и как выяснилось, он также обладает подвижностью углеродного скелета.
В состав доменов I и II АФП человека входят по 186 а.о. (2-187 и 194-379 соответственно), а домен III состоит из 192 а.о. (386-577).
Изоформы молекулы АФП млекопитающих были впервые исследованы на грызунах. Несмотря на то, что все типы мРНК молекулы АФП были транслированы in vitro, не все из них были обнаружены in vivo. В данном обзоре, рассматривается АФП с молекулярной массой 68-73 кДа в зависимости от степени гликозилирования, транслированную из 2,2 -Кб транскрипта. Тем не менее, существуют различные изоформы мРНК. Так, в печени эмбрионов крыс сначала экспрессируется 2,2-Кб транскрипт, из которого в дальнейшем образуется 1,7-Кб мРНК, транслируемая в белок с молекулярными массами 50-65 кДа. Печень новорожденных крыс помимо
2,2 и 1,7-Кб транскриптов экспрессирует еще и 1,5-Кб, который транслируется в 48 кДа белок, причем данная изоформа наблюдается только в течение первых 4-8 недель жизни.
Особого рассмотрения требует 1,35-Кб изоформа (37 к Да), найденная в печени взрослых крыс, поскольку именно она была обнаружена в клетках карциномы человека. Эта изоформа может составлять до 40% молекул человеческого АФП, транслированного из нормального 2,2-Кб транскрипта; у нее отсутствует целиком домен I и одна треть домена II. Интересно, что элиминации подвергается именно эти домены, то есть N-концевая часть молекулы АФП, поскольку как было установлено, N-концевой участок определяет основные отличия АФП крысы от АФП других млекопитающих (в том числе человека). Третий домен содержит мотивы гетеродимеризации, а также сайт, узнаваемый рецептором АФП [88].