Вариабельность переносимых иксодовыми клещами бактерий семейства Anaplasmataceae на территории азиатской части России

• Автор: Рар, Вера Александровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 128 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общая характеристика эрлихиозов и их инфекционных агентов
1.1.1. История изучения эрлихиозов
1.1.2. Систематика представителей семейства Anaplasmataceae.
1.1.3 Морфология эрлихий и анаплазм
1.1.4. Структура генома
1.1.5. Клиника, лечение
1.1.6. Диагностика
1.1.7. Эпидемиология
1.2. Молекулярно-генетическая характеристика отдельных представителей семейства Anaplasmataceae
1.2.1. Характеристика бактерий рода Anaplasma
1.2.1.1. Anaplasmaphagocytophilum
1.2.1.1.1. Специфичные переносчики A. phagocytophilum
1.2.1.1.2. Резервуарные хозяева A. phagocytophilum на территории США
1.2.1.1.3. Резервуарные хозяева A. phagocytophilum на территории Евразии
1.2.1.1.4. Генетическая вариабельность A. phagocytophilum
1.2.1.2. Внутриэритроцитарные анаплазмы
1.2.1.3. Anaplasma bovis
1.2.1.4. Anaplasma platys
1.2.2. Характеристика бактерий рода Ehrlichia
1.2.2.1. Ehrlichia chaffeensis
1.2.2.1.1. Распространение Ehrlichia chaffeensis в природных очагах
1.2.2.1.2. Генетическая вариабельность Е. chaffeensis
1.2.2.2. Ehrlichia canis
1.2.2.3. Ehrlichia ewingii
1.2.2.4. Ehrlichia muris
1.2.2.5. Ehrlichia ruminantium
1.2.2.6. Новые генетические варианты эрлихий
1.2.3. Характеристика бактерий “Candidatus Neoehrlichia spp.”
1.2.3.1. “Candidatus Neoehrlichia mikurensis”
1.2.3.2. "Candidatus Neoehrlichia lotoris”
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.2. Буферы и основные растворы
2.3. Медико-биологические образцы
2.3.1. Иксодовые клещи
2.3.2. Образцы крови и тканей мелких млекопитающих
2.3.3. Образцы крови больных
2.4. Выделение ДНК
2.4.1. Выделение ДНК из иксодовых клещей
2.4.2. Выделение ДНК из образцов крови
2.4.3. Выделение ДНК из образцов ткани
2.5. Выявление ДНК бактерий из семейства Anaplasmataceae методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)
2.5.1. Синтетические олигонуклеотиды
2.5.2. Постановка ПЦР
2.5.3. Электрофоретическая детекция продуктов ПЦР
2.5.4. Определения нуклеотидных последовательностей
2.5.5. Анализ нуклеотидных последовательностей
2.5.6. Номера доступа использованных в работе
нуклеотидных последовательностей в базе данных GenBank
2.6. Проведение иммуноферментного анализа
2.7. Проведение статистического анализа
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выявление ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae в иксодовых
клещах
3.1.2. Вьивление ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae в клещах рода Ixodes
3.1.2. Выявление ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae в клещах
Haemaphysalis spp. и Dermacentor silvarum на территории Хабаровского края
3.2. Выявление ДНК бактерий семейства Anaplasmataceae в мелких млекопитающих
3.3. Выявление ДНК эрлихий и анаплазм в личинках и нимфах, снятых с
мелких млекопитающих
3.4. Изучение сезонной динамики частоты встречаемости инфицированных эрлихиями и анаплазмами мелких млекопитающих на территории Хабаровского края
3.5. Молекулярно-генетический анализ бактерий из семейства Anaplasmataceae
3.5.1. Изучение генетической вариабельности Е. mûris и новых генетических вариантов Ehrlichia spp
3.5.2. Изучение генетической вариабельности “Candidatus N. mikurensis”
3.5.3. Изучение генетической вариабельности нетипичных бакетерий
семейства Anaplasmataceae
3.5.4. Изучение генетической вариабельности A. phagocytophilum
3.6. Выявление аетител к возбудителям ГАЧ и МЭЧ в крови пациентов
на территории Новосибирской области
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
а.о. - аминокислотный остаток
ед. акт. - единицы активности
ИФА - иммуноферментный анализ
ИКБ - иксодовые клещевые боррелиозы
ГАЧ - гранулоцитарный анаплазмоз человека
кДа - килодальтон
КЭ - клещевой энцефалит
МИКБ №1 - муниципальная инфекционная клиническая больница №1
МЭЧ - моноцитарный эрлихиоз человека
н.о. - нуклеотидный остаток
ННЦ - Новосибирский научный центр
н.п. - нуклеотидная пара
ПЦР - полимеразная цепная реакция
рРНК - рибосомальная РНК
РНИФ - реакция непрямой иммунофлуоресценции
Трис - трис-(гидроксиметил)-аминометан
ЭДТА - этилендиамин N,N,N',N'-TeTpayKcycHaH кислота
ACT - аспартатаминотрансфераза
ALT - аланинаминотрансфераза
Big DyerMddNTP- флуоресцентно меченые Big Dye™ дидезоксинуклеозид-5'-трифосфаты dNTP-дезоксинуклеозид 5-трифосфат IgM - иммуноглобулины класса М IgG - иммуноглобулины класса G
ME - метод минимальной эволюции (Minimum Evolution)
NJ - метод объединения ближайших соседей (Neighbor-Joining)
PLT - тромбоциты (platelet)
Tag ДНК-полимераза - ДНК-полимераза, выделенная из Thermus aquaticus
UPMGA - метод невзвешенного попарного среднего (Unweighted Pair Group Method with
Arithmetic mean)
WBC - лейкоциты (white blood cells)
вариабельными и подходящими для филогенетического анализа. GroESL оперон белков теплового шока широко используется для дифференциации штаммов А. phagocytophilum, циркулирующих в различных хозяевах и на территории различных регионов.
GroESL оперон содержит два гена, кодирующих белки GroES и GroEL, а также разделяющий их межгенный спейсер. Как правило, для сравнения изолятов А. phagocytophilum используют фрагмент оперона длиной около 1200 и.о
содержащий часть межгенного спейсера и б’-фрагмент гена groEL. К настоящему времени установлено около 50 различных вариантов последовательностей groESL оперона для образцов A. phagocytophilum из Европы и США, большинство из которых подразделяются на два кластера (Petrovec et al., 2002; von Loewenich et al., 2003; Alberti et al., 2005; Rymaszewska, 2008; Katargina et al., 2011). Первый кластер объединяет последовательности A. phagocytophilum из широкого круга позвоночных хозяев, включая больных людей, оленей, косуль, овец, лошадей, а также из клещей I. ricinus, а второй кластер - только последовательности A. phagocytophilum из косуль и I. ricinus. Отдельную группу в первом кластере составляют последовательности штаммов, изолированных из клещей I. pacificus, собак, лошадей и больных людей на территории США, а также из собак и лошадей в Сардинии (Италия) (Alberti et al., 2005). Следует отметить, что, по крайней мере, две последовательности groESL оперона А. phagocytophilum не могут быть отнесены ни к одному из этих кластеров, это последовательности A. phagocytophilum от козы из Албании (GenBank AY279085) и рыжих полевок из Швейцарии (GenBank AF192796) (Liz et al., 2000; Petrovec et al., 2003). В отличие от нуклеотидных последовательностей, выведенные аминокислотные последовательности белка GroEL являются высококонсервативными; последовательности, относящиеся к разным кластерам, различаются лишь по одному аминокислотному остатку - последовательности из первого кластера содержат аминокислоту серии по 242 позиции белка GroEL, а из второго кластера - аминокислоту аланин (Petrovec et al., 2002; Katargina et al., 2011).
Не во всех случаях последовательности гена 16S рРНК и groESL оперона были определены для одних и тех же образцов. Тем не менее, в большинстве известных случаев образцы A. phagocytophilum из первого по groESL оперону кластера содержат последовательности гена 16S рРНК, соответствующие 1, 2, 5, 7 и в