Структурно-функциональные предпосылки формирования piРНК-продуцирующих локусов у Drosophila melanogaster

• Автор: Оловников, Иван Алексеевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 95 с. : ил.

Содержание
Введение
Список сокращений
Обзор литературы
I. РНК интерференция. Механизмы регуляции экспрессии с помощью коротких РНК.
1а. Биогенез и функция siPHK и miPHK
16. Биохимический путь с участием piPHK
II. Биология piPHK кластеров
На. Происхождение piPHK в герминальных тканях Drosophila
piPHK кластеры фолликулярных клеток дрозофилы
piPHK кластеры в герминальных клетках яичника дрозофилы
piPHK кластеры в семенниках дрозофилы
116. Факторы, необходимые для активности piPHK кластеров. Структура хроматина piPHK кластеров
Ив. Сравнение piPHK кластеров разных организмов
Материалы и методы
Результаты
I. Свойства коротких РНК, генерируемых трансгеном, встроенным в 41 эндогенный piPHK кластер
II. Исследование транспозонных piPHK кластеров с использованием 44 трансгенных конструкций
III. Исследование свойств генного piPHK кластера Traffic Jam
IV. Трансген- ассоциированные piPHK кластеры

Обсуждение
Выводы
Список литературы
Благодарности

Введение
Короткие РНК, ассоциированные с белками семейства Argonaute (Ago), играют важную роль в регуляции экспрессии генов на всех стадиях развития в большинстве изученных эукариот. Анализ коротких РНК из гонад различных животных, помимо уже известных siPHK (small interfering РНК) и miPHK (micro РНК), обнаружил отдельный класс коротких РНК, которые получили название piPHK (Piwi- interacting РНК) (Senti and Brennecke, 2010; Siomi et al., 2011). Как видно из их названия, биология piPHK неразрывно связана с белками подсемейства Piwi из семейства Ago. Главной функцией piPHK является защита генома от активности мобильных элементов (МЭ), повышенная экспрессия которых в предшественниках половых клеток может привести к высокой частоте транспозиций и передаче потомству инсерционных мутаций. piPHK позволяют подавлять экспрессию МЭ путем разрезания их мРНК за счет эндонуклеолитической активности белков Piwi, а также за счет процессов сайленсинга на транскрипционном уровне (Le Thomas et al., 2013; Shpiz et al., 2011; Sienski et al., 2012; Song et al., 2004).
Биогенез piPHK отличается от биогенеза siPHK и miPHK рядом особенностей. Наиболее важной из них является то, что большая часть piPHK происходит из дискретных локусов, лишенных генов, но обогащенных фрагментами разрушенных МЭ (Brennecke et al., 2007). Эти локусы, называемые piPHK кластерами, многочисленны (к примеру, -150 кластеров у дрозофилы) и могут быть протяженными (более 200 т.п.о.). В случае дрозофилы piPHK кластеры расположены, как правило, в перицентромерных или субтеломерных областях хромосом и суммарно составляют примерно 3.5% генома. piPHK кластеры являются центральным звеном piPHK пути, так как мутации, приводящие к нарушению их работы, приводят к остановке всего piPHK пути и драматическому повышению частоты транспозиции МЭ, вызывающей стерильность (Kalmykova et al., 2005; Klattenhoff et al., 2009; Savitsky et al., 2006; Zhang et al., 2012). Кроме того, piPHK кластеры обеспечивают адаптивность piPHK- ответа при инвазиях новых МЭ, ибо интеграция МЭ в эти локусы провоцирует синтез новых piPHK (Khurana et al., 2011).
На сегодняшний день остается непонятой не свойственная другим геномным локусам способность piPHK кластеров продуцировать короткие РНК. Исследование

СітЬН), содержащей индуцируемую кассету генов, необходимых для рекомбинации. Для этого 30 мкл свежей ночной культуры были добавлены в 1.4 мл среды ЬВ, содержащей
12.5 мкг/мл хлорамфеникола, и инкубированы при 37°С в течение 2-3 часов с интенсивным перемешиванием. Клетки были отцентрифугированы при +4°С в течение 30 секунд на скорости 11 ООО g и ресуспендированы на льду в 1 мл деионизованной воды (0°С). После повторения промывки, клетки были ресуспендированы в 30 мкл воды (0°С). К клеткам был добавлен 1 мкл плазмиды рЯебЕТ (20 нг/мкл), после чего они были перенесены в электропорационную кювету (0°С), электропорированы при 1.35 кВ, 10 мкФ, 600 Ом и ресуспендированы в 1 мл ЬВ. После подроста культуры при 30°С в течение 70 минут, клетки были посеяны на чашки ЬВ-агар, содержащие 12.5 мкг/мл хлорамфеникола и 3 мкг/мл тетрациклина и выращивались при 30°С.
Для создания кассет lacZ-KanR был использован метод перекрывающегося ПЦР, где один ПЦР-продукт отжигается на другой и служит затравкой, что позволяет объединять фрагменты при амплификации (Рис. 5). Для этого сначала был проведен ПЦР для амплификации 1ас2 (праймеры 308у-300у для 38С или 299у-300у для Х-ирх/геат, используя в качестве матрицы вектор рСа5реР-Ьра1), а также ПЦР для амплификации КапК (праймеры 301у-309у для 38С или 301у-302у для Х-ирт-еат, используя в качестве матрицы вектор рГЮЬгЛ201). После этого соответствующие ПЦР продукты были объединены и использованы в перекрывающемся ПЦР (308у-309у для 38С или 299у-302у для Х-ирБІгесті).
Для проведения рекомбиниринга с помощью полученных кассет 30 мкл ночных культур, содержащих плазмиду рРесПП', были засеяны в 1.4 мл среды ЬВ, содержащей хлорамфеникол и тетрациклин и инкубированы при 30°С в течение 2 часов. После этого к культуре добавляли 50 мкл 10% Ь-арабинозы (реплики без арабинозы служили контролем) для индукции синтеза генов рекомбинации с плазмиды рЯебЕТ, и инкубировали в течение 1 часа при 37°С для удаления температуро-чувствительной плазмиды рРесІЕТ. После этого проводилась электропорация контрольных и индуцированных клеток как описано выше, но с использованием 2 мкл очищенного ПЦР продукта кассеты 1ас2-КапЯ (-100 нг/мкл). После электропорации клетки растились при 37°С вместо 30°С и высевались на чашки ЬВ с хлорамфениколом и канамицином. Клоны с кластером 38С проверялись с помощью ПЦР