Рекомбинантные миниантитела человека в формате scFv к энтеротоксину A стафилококков : получение и характеристика

• Автор: Фурсова, Ксения Константиновна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 132 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Энтеротоксины стафилококков

1.1.1. Стафилококки - условно-патогенные микроорганизмы

1.1.2. Энтеротоксины стафилококков

1.1.3. Молекулярная структура стафилококкового энтеро гоксина А

1.1.4. Механизм действия энтеротоксинов стафилококков

1.1.5. Методы молекулярной детекции стафилококковых энтеротоксинов

1.2. Антитела

1.2.1. Структура иммуноглобулинов

1.2.2. Разнообразие форматов антител
1.2.3. Методы и технологии получения эсБу
1.2.4. Экспрессия бсЕу
1.2.5. Применение антител
1.3. Продукция рекомбинантных белков в клетках Е.соИ
1.3.1. Основные аспекты рефолдинга
1.3.2. Выделение телец включения
1.3.3. Способы рефолдинга белка
1.3.4. Добавки при рефолдинге
1.3.5. Вклад дисульфидных связей в белковый фолдинг
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы исследования
2.2. Методы
2.2.1. Аффинная селекция миниантител из фаговой библиотеки
2.2.2. Скрининг индивидуальных продуцентов из фаговой библиотеки
2.2.3. Выделение фаговых частиц
2.2.4. ИФА всБу в фаговом формате
2.2.5. ИФА всБу-фрагментов
2.2.6. «Сэндвич»-иммуноанализ на иммунопланшетах
2.2.7. Иммуно-ПЦР в фаговом формате
2.2.8. Клонирование генов миниантител в экспрессионный вектор
2.2.9. Трансформация и анализ клонов Е.соН
2.2.10. Экспрессия эсЕу в клетках Е.соН
2.2.11. Анализ уровня синтеза бсЕу
2.2.12. Экспрессия и выделение всБу из телец включения
2.2.13. Экспрессия и выделение растворимых «сБу
2.2.14. Рефолдинг миниантител с помощью металл-хелатной хроматографии
2.2.15. Рефолдинг миниантител гельфильтрацией
2.2.16. Определение аргинина с помощью тонкослойной хроматографии
2.2.17. Электрофоретический анализ белковых препаратов в нативных условиях
2.2.18. Регистрация спектров кругового дихроизма
2.2.19. Определение констант диссоциации
2.2.20. Эпитопный анализ стафилококкового энтеротоксина А
2.2.21. Иммуно-блот анализ
2.2.22. Лиофилизация миниантитсл
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Миниантитела в фаговом формате
3.1.1. Получение ясЕу фрагментов в составе фаговой частицы
3.1.2. Использование фаговых миниантител для детекции
3.2. Миниантитела всБу

3.2.1. Анализ уровня синтеза миниантител
3.2.1.1. Выделение миниантител из растворимой фракции
3.2.1.2. Выделение миниантител в денатурирующих условиях
3.3. Оценка стабильности миниантител при различных условиях хранения
3.4. Характеристика миниантител
3.4.1. Аффинность миниантител в отношении SEA
3.4.2. Анализ взаимодействия миниантител с родственными стафилококковыми энтеротоксинами
3.4.3. Эпитопный анализ стафилококкового энтеротоксина А
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования
Бактерии рода Staphylococcus являются одной из основных причин пищевых отравлений и аутоиммунных расстройств. К причинам патогенности Staphylococcus aureus относятся факторы вирулентности вырабатываемые бактерией - это и факторы адгезии, и разнообразные ферменты, играющие роль факторов «агрессии и защиты», и комплекс секретируемых экзотоксинов (Becker et al., 2003). Около 6% синтезируемого клеткой белка составляют энтеротоксины (Thomas et al., 2007; Lowy, 1998). На сегодняшний день описано более 20 энтеротоксинов, среди которых SEA один из наиболее распространенных.
Энтеротоксины - семейство белков с молекулярной массой 23-29 кД, взаимодействующих с антигенами гистосовместимости (MHC-II) и Т-клеточным рецептором (TCR) (Thomas et al., 2009). В результате такого взаимодействия является образование комплекса из двух видов клеток и антигена, провоцирующий гипериммунный ответ (Proft, Fraser, 2003).
Отравление пищевыми продуктами, содержащими энтеротоксины стафилококков, широко распространено и находится на втором месте после отравлений, вызываемых сальмонельными инфекциями (Lowy, 1998; Le Louir et al., 2003). При пищевых отравлениях возможны различные осложнения, включая развитие пневмонии (Cheng et al., 2012), аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (Howell et al.,1991.), атопический дерматит (Ikezawa et al., 2010; Niebuhr et al., 2010), и аллергические заболевания. Синтезируемые бактериями энтеротоксины могут проникать в кровоток не только через ткани желудочно-кишечного тракта, но и через эпителиальные ткани дыхательных путей и кожных покровов (Balaban, Rasooly, 2000; Peterson et al., 2005).
Таким образом, задача детекции и нейтрализации токсинов является актуальной в здравоохранении, и представляет интерес для современной науки. Вакцинация пациентов природным антигеном осложняется ответной

Обычно клонируемые белки или пептиды синтезируются в виде слитных белков в составе одного из поверхностных белков оболочки pill или pVIII (Рисунок
10). Генетическая информация такого слитного белка находится в той же фаговой частице в составе одноцепочной ДНК (Johns, 2000).
pVtl (-5) pix (-5)
j- < 10 nm

- 1 |im
Рисунок 10 - Схематическое изображение фага М13 (адаптировано Willats, 2002). Белки капсида фага обозначены римскими цифрами. Белок рШ -используется в качестве белка партнера и представляет ограниченное число копий (максимум 5), белок pVIII используют в качестве партнера при высококопийном представлении рекомбинантного белка (до нескольких тысяч). В скобках указано количество копий белка на фаговую частицу
Фаг-дисплейные системы подразделяются на два класса на основе векторной системы, используемой для клонирования целевой последовательности. Так называемые «настоящие» фаговые векторы конструируются на основе ДНК нитевидных фагов (М13, fl, fd). Такие векторы кодируют все фаговые белки, необходимые для жизненного цикла фага, его репликации и сборки. В такие векторы библиотека клонируется обычно, либо в составе слитного белка поверхности фага, уже присутствующего в геноме, либо вводится в виде кассеты с добавочной копией поверхностного белка рШ. Оба типа на основе фаговых векторов позволяют синтезировать все белки, необходимые для репликации и сборки фаговой частицы (Pini, Bracci, 2000).
Второй класс фаг-дисплейных систем основан на использовании фагмидных векторов, с последующей продукцией целевого белка слитного с поверхностным белком. Данный способ имеет большую эффективность трансформации по сравнению с использованием фаговых векторов. Фагмидный вектор представляет собой плазмиду, имеющую наряду со своей точкой инициации репликации дополнительный фаговый ориджин. Также в векторе
pill (~5) pVI (-5) pVIII (-2,700)