Генетически кодируемые флуоресцентные инструменты для исследования живых систем

• Автор: Чудаков, Дмитрий Михайлович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 241 с. : ил.

Оглавление
Определения

Список сокращений g

Введение

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Происхождение и предполагаемые функции GFP-подобных белков ]

A. Происхождение GFP-подобных белков

B. Биологические функции GFP-подобных белков

1.2. Пространственная структура и разнообразие хромофоров

A. Структура GFP-подобных белков

B. Хромофор зеленых флуоресцентных белков

C. Природное разнообразие хромофоров GFP-подобных белков
D. Хромофоры и спектральные варианты мутантных вариантов ФБ З
1.3. Характеристики ФБ, существенные для практического применения
A. Яркость флуоресцентного сигнала
B. Скорость созревания хромофора
C. Фотостабилыгасть и нежелательная фотоконверсия
D. Олигомеризация и агрегация
E. рН-стабильность
1.4. Основные методы с использованием ФБ
A. Мечение белков слияния
B. Технологии фотообесцвечивания
C. Внутриклеточная локализация
D. Визуализация активности промоторов
E. Клеточные «таймеры»
F. Мечепие клеток и тканей
G. Мечение ДНК и РНК
1.5. Исследование белок-белковых взаимодействий с использованием ФБ
A. Ферстеровский резонансный перенос энергии (FRET)
B. Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия (FCCS)
C. Флуоресцентная комплементация (расщепление флуоресцентных белков)
1.6. Фотоактивируемые флуоресцентные белки
A. Структурная основа для фотоактивации
B. Ключевые параметры фотоактивируемых флуоресцентных белков
C. Обратимо фотоактивируемые флуоресцентные белки
D. Необратимо фотоактивируемые флуоресцентные белки
E. Флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения

1.7. Генетически кодируемые сенсоры на основе ФБ
A. Возможности генетически кодируемых сенсоров
B. Сенсоры на основе одного ФБ без дополнительных белковых доменов
C. Сенсоры на основе ФБ, слитного с чувствительным белковым доменом
D. Сенсоры на основе эффекта FRET
E. Сенсоры на основе транслокации
Цели и задачи работы
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
A. Тантика и стратегия получения и оптимизации флуоресцентных белков
B. Оборудование
C. Реактивы
D. Бактериальные штаммы и клеточные линии
E. Методы исследования и анализа данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Мономерные флуоресцентные белки для мечения целевых белков
A. TagRFP: яркий красный мономерный флуоресцентный белок
B. mKate и mKate2: мономерные дальнекрасные флуоресцентные белки; tdKatushka2
C. Красный «супермономерный» флуоресцентный белок
D. TagBFP: мономерный синий флуоресцентный белок на основе TagRFP
E. Мономерные белки средней части видимого спектра: TagCFP, TagGFP, TagYFP
3.2. Димерные флуоресцентные белки для мечения клеток и тканей
A. Быстро созревающий неагрегнрующин зеленый ФБ TurboGFP
B. Оранжево-красные флуоресцентные белки eqKP578 и TurboRFP '
C. Дальнекрасный флуоресцентный белок Katushka
D. Батохромные варианты белка Katushka - eqFP650 и eqFP670
3.3. Фотоактивнрусмые флуоресцентные белки
A. Высококонтрастиый фотоактивируемый белок PS-CFP2
B. Технология «белковых речек» на основе обратимо фотоактивируемых белков
C. Красные мономерные и «супермономерные» обратимо фотоактивируемые белки
D. Новый тип необратимой фотоконверсии зеленых флуоресцентных белков
E. Повышение фотостабильности зеленых ФБ при визуализации в живых клетках
3.4. Генетически кодируемые сенсоры
A. Сенсоры ионов кальция на основе пермутнрованных флуоресцентных белков
B. Высококонтрастные сенсоры на основе FRET-nap флуоресцентных белков
Выводы
Заключение
Благодарности
Список публикаций по теме диссертации
Список цитируемой литературы

Определения
GFP-подобный белок. Под этим понятием подразумеваются все белки, родственные белку avGFP из Aequorea victoria, то есть имеющие близкую к нему пространственную структуру, включая флуоресцентные белки (ФБ), нефлуоресцентные, но окрашенные хромобелки (ХБ), а также некоторые бесцветные варианты. Соответственно, под термином ФБ здесь мы подразумеваем именно GFP-подобные флуоресцентные белки, но не прочие варианты флуоресцирующих протеинов, такие как, например, белок iLov (Chapman et al, 2008) или билевердин-связывающий белок (Shu et al, 2009).
Нумерация аминокислотных остатков. Для удобства восприятия, нумерация аминокислотных остатков для всех GFP-подобных белков приводится в соответствии с выравниванием с белком avGFP.
Яркость. Под термином «яркость», в зависимости от контекста, подразумевается одна из двух характеристик: расчетная яркость
флуоресценции, получаемая как произведение квантового выхода флуоресценции и коэффициента молярной экстинкции при максимуме возбуждения флуоресценции, либо результирующая (детектируемая) яркость флуоресцентного сигнала в живой системе, которая зависит, помимо расчетной яркости флуоресцентного белка, от ряда других параметров, таких как эффективность транскрипции и трансляции гена флуоресцентного белка, стабильность мРНК, скорость и эффективность (процент) созревания хромофора в данных условиях, скорость деградации флуоресцентного белка в живых клетках.
Фотостабильность. Устойчивость флуоресцентного белка к обесцвечиванию. До сегодняшнего дня не существует единого подхода к сравнению фотостабильности флуоресцентных белков. Более того, в

ФБ. Тем не менее, полученные нами варианты ФБ с повышенной яркостью эмиссии флуоресценции в синей и дальнекрасной областях спектра (см. результаты, разделы 3.1 и 3.2.) указывают на то, что некоторый прогресс в данном направлении еще возможен.
Существенно, что повышение яркости флуоресценции ФБ в ходе их оптимизации может происходить в ущерб некоторым другим их характеристикам, таким как мономерность ФБ, фотостабильность флуоресцентного сигнала, а также устойчивость флуоресценции к изменениям значения pH. В то же время, например, ФБ с низкой яркостью, но высокой фотостабильностью, может давать более низкий уровень шума при регистрации сигнала, особенно при долговременных экспериментах. Поэтому, важно помнить, что яркость флуоресценции - не единственный параметр, который должен учитываться при выборе ФБ для конкретной области применения.
Также необходимо помнить, что яркость флуоресценции, измеренная в образцах ФБ in vitro, не может быть прямо экстраполирована на их яркость in vivo. Действительно, конечная яркость сигнала, полученного от продуцируемого в живых клетках ФБ, определяется не только его спектральными характеристиками, но и набором других параметров, включающих уровень транскрипции и трансляции, стабильность мРНК и скорость деградации ФБ, а также скорость созревания хромофора (см. ниже). Все эти параметры могут отличаться для различных ФБ и включающих их химерных конструкций, отличаться для различных живых систем. Кроме того, показано, что яркость флуоресценции может зависеть от агрегации ФБ (Zubova et al, 2005). Наконец, следует отметить, что ФБ часто демонстрируют более высокую яркость флуоресценции при визуализации на уровне одной молекулы, по сравнению со средней яркостью молекул в образце белка (Stiel et al, 2008).