Взаимодействие Citrobacter freundii метионин - γ-лиазы с субстратами и ингибиторами в растворе и кристалле

• Автор: Морозова, Елена Андреевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 93 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Пиридоксаль-5'- фосфат зависимые ферменты, участвующие в метаболизме серосодержащих аминокислот, как мишени для рационального дизайна новых лекарственных средств.
1. Химические основы многообразия реакций, катализируемых ПЛФ-зависимыми ферментами

1.2. Механизм реакций, катализируемых ПЛФ-зависимыми лиазами

1.3. Механизмы ингибирования ПЛФ-зависимыми ферментов

1.3.1. Нековалентная инактивация

1.3.2. Активированные нуклеофилы

1.3.3. Активированные электрофилы
1.3.4. Проблема специфичности потенциальных ингибиторов
2. ПЛФ-зависимые ферменты, участвующие в метаболизме серосодержащих аминокислот
2.1. Сравнительный анализ хода полипептидной цепи в молекулах ПЛФ-зависимых ферментов, участвующих в метаболизме метионина и цистеина
3. Ферменты метаболизма серосодержащих аминокислот — новая мишень для лекарственных средств
3.1. Цистатионин-у-синтаза
3.2. Цистатионин-Р-лиаза
3.3. Цистатионин-у-лиаза
3.4. Цистализин

3.5. Цистатионин-Р-синтаза
3.6. О-Ацетилсерин-сульфогидролаза
3.7. Метионин-у-лиаза
3.7.1. Структурные различия между бактериальной МГЛ
и человеческой ЦГЛ
3.7.2. МГЛ как потенциальная мишень для антимикробных агентов
II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Введение
2.2. Кинетические параметры взаимодействия МГЛ с субстратами и
ингибиторами
2.3. Кинетика обмена а- и Р-протонов конкурентных ингибиторов МГЛ
2.4. Установление химии ПЛФ в двух пространственных структурах МГЛ
2.5. Спектральные характеристики комплексов фермента с аминокислотами в растворе и кристалле
2.6. Взаимодействие МГЛ с Ь-циклосерином
ВЫВОДЫ
III. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Выращивание бактериальной массы, выделение и очистка фермента
3.2. Определение концентрации белка
3.3. Определение активности фермента
3.4. Определение чистоты выделенного фермента
3.5. Получение 2-[2Н]-аминокислот
3.6. Кинетические исследования
3.7. Спектральные исследования фермента
3.8. Кристаллизация МГЛ
3.9. Микроспектрофотометрические исследования кристаллов МГЛ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ПЛФ - пиридоксаль-5'-фосфат;
МГЛ - метионин-у-лиаза;
ПМФ - пиридоксамин-5'-фосфат;
АСС-синтаза - 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат-синтаза;
ЦГС - цистатионин-у-синтаза;
ЦБЛ - цистатионин-(}-лиазы;
ЦБС - цистатионин-р-синтаза;
ОАСС - О-Ацетилсерин-сульфогидролаза;
КД - круговой дихроизм;
ПО - поляризационное отношение;
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат;
ДЕАЕ-целлюлоза - диэтиламиноэтил-целлюлоза;
NADH - Р-никотинамидадениндинуклеотид восстановленный динатриевая соль;
Tris - трис(гидроксиметил)аминометан;
PEG MME 2000 - монометиловый эфир полиэтиленгликоля 2000.
приводят к наследственному заболеванию - гомоцистинурии [76]. Кроме того, повышение уровня гомоцистеина в крови является независимым фактором риска для атеросклеротических, кардиоваскулярных, цереброваскулярных болезней, глубокого тромбоза вен и тромбоэмболии [77]. Знание каталитического механизма ЦБС и возможностей его регулирования представляет собой большой интерес для медицины. Разработка аллостерических эффекторов, способных увеличивать активность фермента, может активно применяться в терапии кардиоваскулярных болезней. Недавно было предположено, что ингибирование ЦБС может стать новым подходом в лечении острого инсульта [78].
3.6. О-Ацетилсерин-сульфогидролаза
О-Ацетилсерин-сульфогидролаза (О-ацетилсерин-(тиол)лиаза, Е.С. 2.5.1.47) катализирует последнюю реакцию в биосинтезе цистеина в бактериях, одноклеточных прокариотах и растениях - реакцию ß-замещения, которая приводит к образованию цистеина из О-ацетилсерина и сульфида [79]. Два изофермента - ОАСС-А и ОАСС-Б присутствуют в некоторых бактериях и проявляют различную субстратную специфичность [80]. ОАСС принадлежит к II типу укладки полипептидной цепи ПЛФ-зависимых ферментов.
In vivo ОАСС образует би-ферментный комплекс с АТФ-сульфурилазой и серинацетилтрансферазой. Этот комплекс известен как цистеинсинтаза. При образовании цистеинсинтазы активность ОАСС уменьшается в бактериях [81,82] и растениях [83]. Стабильность этого комплекса связывается с присутствием серы в клетках. О-Ацетилсерин способствует распаду этого комплекса, а присутствие сульфида предотвращает этот процесс [81, 83-85].
Структура гомодимера ОАСС была определена для изофермента А из Salmonella typhimurium [86-88], Haemophilus influenzae [89], Arabidopsis thaliana и для изофермента Б из E.coli [90]. Исследование структуры ОАСС из Salmonella typhimurium в отсутствии [86] и присутствии [88] аналогов субстрата и аллостерических эффекторов указывает на то, что образование внешнего альдимина ПЛФ с L-цистеином, L-серином и L-метионином происходит с конформационными изменениями от открытой (неактивной) до закрытой (активной) структуры. Связывание иона хлора с аллостерическим анион-связывающим центром, локализованным на поверхности димера, стабилизирует конформацию, которая отличается от открытой конформации