Генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры окислительно-восстановительных процессов в живых системах

• Автор: Билан, Дмитрий Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1Л. Активные формы кислорода (АФК) й их роль в клетке
1.1.1. Основные типы АФК и их источники в клетках
1.1.2. Участие АФК в клеточном сигналинге
1.1.3. Антиоксидантные системы клеток
1.1.4. Химические методы регистрации АФК
1.2. Основные редокс пары клетки
1.2.1. Соотношение НАД+/НАДН
1.2.1.1. Структурные особенности НАД, синтез и транспорт
1.2.1.2. Роль НАД+ и НАДН в энергетическом метаболизме клеток
1.2.1.3. Другие функции соотношения НАД+/НАДН
1.2.1.4. Транскрипционный фактор Яех - природный сенсор соотношения НАД+/НАДН
1.2.1.5. Методы регистрации НАД+ и НАДН
1.2.2. Соотношение НАДФ+/НАДФН
1.2.3. Соотношение ОББС/ОБН
1.3. Флуоресцентные белки
1.3.1. Общие структурные особенности флуоресцентных белков
1.3.2. Сенсоры на основе флуоресцентных белков
1.3.3. Флуоресцентные сенсоры для регистрации окислительновосстановительных процессов
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Оборудование
2.2. Материалы
2.3. Методы
2.3.1. Методы молекулярного клонирования
2.3.2. Методы работы с белком
2.3.3. Культура эукариотических клеток
2.3.4. Разведение и трансгенез Оапю гепо
2.3.5. Микроскопия

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Усовершенствование генетически кодируемого биосенсора НуРег, созданного для регистрации пероксида водорода
3.1.1 НуРег-3 - версия биосенсора, сочетающая в себе полезные качества
НуРег и НуРег-
3.1.2. Сравнение аффинности и скорости реакции полученного НуРег-3 с НуРег и НуРег-
3.1.3. Сравнение спектральных характеристик НуРег-3 с НуРеги НуРег-
3.1.4. Сравнение олигомерного состояния НуРег-3 с НуРег и НуРег-2
3.1.5. НуРег с объединенными мутациями A406V и H34Y
3.1.6. Тестирование HyPer-3 in vivo
3.1.7. Использование НуРег-3 и НуРег в FL1M микроскопии
3.2. Создание генетически кодируемого флуоресцентного биосенсора для регистрации соотношения НАД+/НАДН
3.2.1. Конструкция и спектральные характеристики RexYFP
3.2.2. Определение чувствительности RexYFP
3.2.3. Подбор pH-контроля при работе с биосенсором RexYFP в живых системах
3.2.4. Использование RexYFP в клетках эукариот
3.2.5. Сравнение окислительно-восстановительного состояния пула НАД в цитоплазме и матриксе митохондрий с помощью RexYFP
3.2.6. RexYFP по отношению к другим биосенсорам, регистрирующих соотношение НАД+/НАДН
ВЫВОДЫ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Окислительно-восстановительные процессы играют ключевую роль в клетках любых организмов. Широкий спектр биохимических реакций зависит от тонкой регуляции окислительно-восстановительных систем клетки. Некоторые из таких систем, как, например, дыхательная цепь митохондрий, на сегодняшний день довольно подробно изучены. Однако исследования последних десятилетий показали, что многочисленные окислительно-восстановительные преобразования внутри клеток в ответ на разные стимулы формируют очень сложную сеть взаимодействующих компонентов и требуют их дальнейшего изучения. Окислительно-восстановительные процессы подразумевают направленные потоки электронов, в переносе которых участвуют самые различные соединения. Некоторые соединения, представленные в клетке параллельно в окисленном и восстановленном состояниях, формируют универсальные сопряженные окислительно-восстановительные или, так называемые, активные редокс пары. Среди таких редокс пар следует отметить НАД+/НАДН, НАДФ+/НАДФН и окисленный/восстановленный глутатион (ОБЗО/ОЗН). Универсальность этих редокс пар заключается в том, что они участвуют в регуляции самых разнообразных клеточных процессов, поэтому соотношение окисленной и восстановленной форм этих соединений являются важными клеточными показателями.
Для аэробных организмов кислород занимает важнейшее место в регуляции жизненно необходимых внутриклеточных процессов, в том числе и окислительновосстановительных. В дыхательных электронтранспортных цепях, производящих энергию, именно кислород служит конечным акцептором электронов. На этом роль кислорода в живых клетках не ограничивается. К настоящему времени накопилось достаточно данных, на основании которых можно утверждать о сигнальных функциях кислорода, которые осуществляются через его активные формы (АФК). АФК образуются в ходе протекания многих биохимических процессов как спонтанно, так и целенаправленно. На раннем этапе АФК приписывали негативную роль, поскольку они способны вызывать окислительные повреждения макромолекул. По этой причине они вовлечены в формирование многих патологических состояний, а также в процессы старения. Но оказалось, что АФК образуются и при нормальном физиологическом состоянии клеток, при этом их концентрация и время жизни строго контролируются специализированными системами. Особое внимание уделяют пероксиду водорода, Н2О2, который активирует клеточные сигнальные каскады и выступает в качестве вторичного мессенджера.

НАД4- способствует удалению от окисляемого субстрата двух атомов водорода в виде протона Н+ и гидрид иона Н . При этом Н+ высвобождается в окружающую среду. Один электрон Н перемещается к азоту никотинамидного кольца, заряжая его, а оставшийся атом водорода присоединяется к четвертому по положению атому углерода, напротив азота. Этот процесс обратим, и восстановленная молекула НАДН в дальнейшем может передавать восстановительные эквиваленты этому же или другому окисленному субстрату [158].
Для большинства тканей общая концентрация НАД+ и НАДН составляет примерно 10"5 М [158]. Но более важным клеточным параметром является именно соотношение окисленной и восстановленной форм данного кофактора. От этого зависят многие метаболические процессы. В митохондриях соотношение НАД+/НАДН может изменяться в пределах от 7-8 до 1, в то время как в цитоплазме величина этого параметра может иметь более широкий диапазон изменений: от 700 до 1 [153, 159, 160].
В клетках существует несколько путей синтеза НАД+. В самом простом случае молекула НАД может быть получена из уже имеющихся в клетке никотинамидсодержащих молекул [153], например, из молекулы витамина ниацина [161]. При недостатке ниацина в клетках млекопитающих никотинамидсодержащие молекулы могут синтезироваться из более простых соединений. L-триптофан может быть превращен в L-кинуренин, который в дальнейшем преобразуется в хинолиновую кислоту. Хинолиновая кислота превращается в никотинат мононуклеотид [153, 162]. Ключевым ферментом синтеза НАД, независимо по какому пути он происходит, является мононуклеотидаденилтрансфераза (NMNAT). NMNAT осуществляет обратимую реакцию синтеза НАД из никотинамидмононуклеотида с использованием энергии АТФ [162, 163].
В настоящий момент известно несколько изоформ мононуклеотид аденилтрансфераз с разной локализацией в клетке: ядерная NMNAT-1,
митохондриальная NMNAT-3 и NMNAT-2, локализованная в аппарате Гольджи [162-164]. Подобная компартментализация изоформ этого фермента может свидетельствовать об осуществлении независимого синтеза НАД в соответствующих органеллах клетки [163].
Исследования in vitro показали, что NMNAT-1 может взаимодействовать с ферментом поли(АДФ-рибоза)полимеразой-1 (PARP-1) и ингибировать его активность [165]. Различные PARP являются одними из главных потребителей клеточного НАД+, поскольку с его участием эти ферменты осуществляют такую посттрансляционную