Исследование механизма цитотоксического действия белкового комплекса Tag7-Hsp70 на опухолевые клетки

• Автор: Шелудченков, Антон Александрович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Пути клеточной смерти

1.1.1. Апоптоз

1.1.2. Некроз: нерегулируемый и программируемый

1.1.3. Аутофаговая клеточная смерть

1.1.4. Другие типы клеточной смерти

1.1.5. Участие лизпсом в механизмах клеточной смерти

1.2. Основные лиганды и рецепторы запуска запрограммированной клеточной смерти
1.2.1. Общие сведения о лигандах и рецепторах клеточной смерти
1.2.2. Общие сигнальные процессы, запускаемые рецепторами смерти
7.2.3. Рецептор TNF-R1 и его лиганд TNF-a
1.2.4. Рецептор Fas и его лиганд FasL
1.2.5. Рецепторы TRAIL-R и лиганд TRAIL
1.3. Белок Tag7 как представитель семейства PGLYRP
1.4. Цитотоксический белковый комплекс Tag7-Hsp
1.5. Белок-шаперон Hsp
1.6. Белок IIspBPl - кошаперон Hsp
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Влияние белка HspBPl на цитотоксическое действие белкового комплекса Tag7-Hsp
2.2. Исследование механизмов цитотоксичсских процессов, запускаемых в клетках опухолевой линии L-929 под действием белкового комплекса Tag7-Hsp
2.3. Выявление рецептора на поверхности клеток L-929, способного взаимодействовать с комплексом Tag7-Hsp
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Белки, ферменты и реактивы
3.2. Получение и очистка белков

3.3. Получение белковых комплексов,
3.5. Мечение биотином
3.6. Культивирование клеточных линий, использованных в работе
3.7. Получение отдельных клонов клеток Ь-
3.8. Аффинная хроматография
3.9. Элетрофорез и вестсрн-блотгинг
3.11. Иммуноферментный анализ (ИФА)
3.12. Выделение мембранного рецептора
3.13. Определение цитотоксической активности
3.14. Микроскопия
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

Список сокращении
CAD - каспазо-активируемая ДНКаза (caspase activated DNAse)
DISC - индуцирующий смерть сигнальный комплекс (death-inducing signaling complex)
FADD - Fas-ассоциированный белок с доменом смерти (Fas-associated protein
with death domain)
HLA - человеческий лейкоцитарный антиген (human leucocyte antigen)
Hsp70/HSP70-lA - белок теплового шока молекулярной массой 70 кДа (heat
shock protein 70 kDa)
HspBPl - ТЬр70-связывающий белок 1 (Hsp70 binding protein 1)
ICAD - ингибитор каспазо-активируемой ДНКазы (inhibitor of caspase activated DNAse)
JNKs - c-Jun-N-терминальные киназы (c-Jun N-terminal kinases)
LMP - пермеабилизация лизосомалыюй мембраны (lysosomal membrane permeabilization)
MOMP - пермеабилизация внешней митохондриальной мембраны (mitochondrial outer membrane permeabilization)
NCCD - Комитет по номенклатуре клеточной смерти (Nomenclature Committee
on Cell Death)
NEF - фактор обмена нуклеотидов (nucleotide-exchange factor)
PARP - поли(АДФ-рибоза)-полимераза (poly(ADP-ribose) polymerase) PGRP/PGLYRP - пептидогликан распознающий белок (peptidoglycan recognition protein)
SDS — додецил сульфата натрия (sodium dodecil sulfate)
TRADD - TNFR-ассоциированный белок с доменом смерти (TNFR-associated death domain protein)
TNF - фактор некроза опухоли (tumor necrosis factor)
TNFR- рецептор к фактору некроза опухоли (tumor necrosis factor receptor) TRAIL - апоптоз-индуцирующий лиганд семейства TNF (TNF-related apoptosis-inducing ligand)
TRAILR - рецептор к апоптоз-индуцирующему лиганду семейства TNF (TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor)

вызывая выход лизосомальных катепсинов в цитозоль клетки, что приводит к запуску клеточной смерти (Vanlangenakker et al., 2008).
Белки семейства Bcl-2, регулирующие индукцию МОМР, способны также участвовать в запуске LMP. Так, белок Вах способен транслоцироваться из цитозоля в лизосомальную мембрану, индуцируя LMP (Kàgedal et al., 2005; Feldstein et al., 2006). При этом с помощью иммунного окрашивания и с использованием конфокального и электронного микроскопов было показано, что в человеческих фибробластах, культивируемых в присутствии староспорина, тирозинкиназного ингибитора широкого спектра действия, происходит транслокация Вах в мембраны лизосом, что вызывает LMP и выход катепсина D из лизосом в цитозоль (Kâgedal et al., 2005). Ингибирование экспрессии Вах методом РНК-интерференции защищает клетки от LMP и апоптоза, вызванных воздействием Н2О2, что также подтверждает участие Вах в индукции LMP (Castino R. et al., 2007). Другой член семейства Вс1-2, белок Bid подсемейства ВНЗ-only, также может быть задействован в запуске LMP. Исследование на клетках с генотипом Bid- продемонстрировали, что LMP и клеточная смерть в гепатоцитах, вызванные воздействием TNF-a, являются Bid-зависимыми (Guicciardi М.Е. et al., 2005). Все эти данные указывают на то, что белки Вах и Bid семейства Вс1-2 способны непосредственно вызывать LMP, независимо от активации МОМР.
Каспазы также могут участвовать в индукции LMP. В частности, стимуляция клеток цитокином TNF-a может индуцировать LMP при участии каспазы-8, что вызывает транслокацию катепсина В из лизосом в цитозоль, индуцируя клеточную смерть (Wemeburg et al., 2004). При этом активация каспаз может как предшествовать LMP, как это было показано для клеток ME-180, так и происходить после LMP, как в случае клеток WEHI-S (Foghsgaard et al., 2001). Для клеток эмбриональных мышиных фибробластов было показано, что рецепторный путь апоптоза может вызывать активацию каспазы-8, которая участвует в активации каспазы 9, индуцирующей LMP и выход лизосомальных катепсинов в цитозоль, осуществляя программу клеточной смерти (Gyrd-Hansen et al., 2006).