Геномная организация и регуляция экспрессии генов теплового шока у организмов с различной термальной адаптацией

• Автор: Астахова, Любовь Николаевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Введение

Г лава 1. Обзор литературы

1.1. Основные аспекты адаптации организмов к неблагоприятным условиям окружающей среды

1.2. Классификация и функции БТШ

1.3. Структура и эволюция генов ТШ

1.4. Экспрессия генов ТШ и ее регуляция

1.5. Участие БТШ в адаптации к экстремальным условиям

1.6. БТШ в медицине

Глава 2. Материалы и методы
2.1. Материалы
2.1.1. Геномная фаговая библиотека
2.1.2. Насекомые, условия обитания и теплового шока
2.1.3. Штаммы Е. соП
2.1.4. Ферменты рестрикции
2.1.5. Зонды
2.1.6. Линии эукариотических клеток, условия культивирования и

2.2. Методы:
2.2.1. Скрининг геномной фаговой библиотеки
2.2.2. Выделение ДНК бактериофага X,
2.2.3. Расщепление ДНК рестрицирующими эндонуклеазами
2.2.4. Электрофорез ДНК
2.2.5. Построение рестриктных карт рекомбинантных фагов
2.2.6. Включение радиоактивной метки в ДНК
2.2.7. Перенос и гибридизация по Саузерну
2.2.8. ПЦР-анализ
2.2.9. Выделение фрагментов ДНК из геля
2.2.10.Клонирование фрагментов ДНК
2.2.11. Трансформация компетентных клеток

2.2.12.Выделение плазмидной ДНК
2.2.13.Секвенирование ДНК
2.2.14.Анализ последовательностей
2.2.15.Выделение фракции лимфоцитов из крови верблюда
2.2.16.Выделение тотальной PIIK
2.2.17.5’- и 3’-RACE анализ и ПЦР с обратной транскрипцией
2.2.18. Электрофорез РНК
2.2.19.Нозерн-гибридизация
2.2.20. Двумерный электрофорез белков по О’Фарреллу
2.2.21. Диск-электрофорез белков с ДДС-Na (по Лэммли) и окрашивание гелей по Кумасси G-250
2.2.22.Идентификация белков методом пептидного фингерпринтинга
2.2.23.Экспрессия и очистка белка GAF
2.2.24.Получение белковых экстрактов
2.2.25. Анализ связывания факторов транскрипции с элементами теплового шока (EMSA)
2.2.26.Получение репортерных конструкций
2.2.27.Трансфекция плазмид и измерение интенсивности люминесценции
Глава 3. Результаты исследования
3.1. Клонирование и анализ структуры кластера генов hsp70A 1 у верблюда Camelus dromedarius
3.2. Дифференциальный анализ экспрессии генов hsplA, hspAlB и hspAlL
3.3. Клонирование и анализ структуры кластера генов hsp83 у S. singularior и О. pardalina
3.4. Сравнение последовательностей генов hsp83 и hsp70 у Stratiomys singularior и Stratiomys japonica
3.5. Анализ экспрессии генов hsp83 у S. singularior и О. pardalina
3.6. Сравнительный анализ структуры промоторных областей
генов группы hspAl верблюда и других видов млекопитающих

3.7. Сравнение активности промоторов hsp70 C. dromedarius и Н. sapiens в культуре клеток НЕК293
3.8. Сравнительный анализ структуры промоторных областей
генов hsp70 и hsp83 S. singularior и О. pardalina
3.9. Сравнение активности промоторов hsp70 S. singularior и D. melanogaster в культуре клеток D. melanogaster Schneider2
3.10. Эффект вставки GAGA-сайтов в промотор гена hsp70S3
3.11. Сравнение активности промоторов hsp83 S. singularior и D. melanogaster в культуре клеток Schneider2
Глава 4. Обсуждение результатов
Выводы
Список литературы
Приложение
Благодарности

В поддержании открытой структуры хроматина в области промоторных областей генов hsp70 и hsp26 и позиционировании РНК-полимеразы II у Drosophila ключевую роль играет продукт гена tri, названный GAGA-binding factor (GAF) благодаря своей способности связываться с последовательностями, состоящими из нескольких повторов GA/CT (Omelina, 2011). Промоторы генов БТШ70 Drosophila содержат несколько сайтов связывания GAF на протяжении 150 п. о. выше старта транскрипции. Показано, что для транскрипции генов hsp70 Drosophila строго необходима множественность GAGA-сайтов при их расположении на определенных расстояниях друг от друга в прямой (GAGA...) и обратной (ТСТС...) ориентации (Wilkins, 1997; Georgei, 2005). Было показано, что деления GAGA-сайтов драматически снижает эффективность транскрипции генов hsp70 D. melanogaster (Georgei, 2005). Функционально активный GAGA-сайт у Drosophila как правило имеет вид GAGAG, GAGAGAG или состоит из нескольких тринуклеотидов GAG, разделенных спейсерами из нечетного числа нуклеотидов (один, три или пять). В некоторых случаях допускаются замены в составе тринуклеотидов (Omelina, 2011; Georgei, 2005). Связывание GAF с промотором hsp70 является сигналом модификации гистона НЗ на всем протяжении транскрибируемой области генов hsp70 и ведет к декомпактизации хроматина.
Помимо модификации хроматина GAF необходим для взаимодействия РНК-полимеразы II с областью инициации транскрипции в комплексе с GTF, в частности, ТВР (TATA-box binding protein). Другие факторы из семейства TFII присутствуют в области промотора генов hsp70 в нормальных условиях, но диссоциируют при ТШ (Lebedeva, 2005). В нормальных условиях связывание РНК-полимеразы II с промоторами генов hsp70 у Drosophila сопровождается синтезом короткого фрагмента мРНК длиной 20 - 40 нуклеотидов, после чего РНК-полимераза переходит в состояние транскрипционной паузы с участием факторов NELF (negative elongation factor) и Spt4/5 (также известного как DSIF), которые ингибируют элонгацию транскрипции. При тепловом шоке взаимодействие активной формы HSF с транскрипционным комплексом приводит к диссоциации NELF, после чего РНК-полимераза II подвергается фосфорилированию в области С-терминального домена большой субъединицы (CTD) с участием протеинкиназы P-TEFb (Wu, 2003; Lee, 2008) и становится способна к продолжению синтеза мРНК, т. е. происходит переход