Дизайн генетических элементов и оптимизация системы гетерологичной экспрессии фактора свертывания крови VIII человека в клетках млекопитающих

• Автор: Орлова, Надежда Александровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

1. Функции фактора VIII в системе гемостаза

2. Структура фактора VIII

2.1 Структура гена FVIII и особенности его экспрессии

2.2 Доменная структура фактора VIII

2.3 Координированные ионы металлов

2.4 Пост-трансляционный процессинг белка-предшественника FVIII

2.4.1 N-гликозилирование

2.4.2 Формирование дисулъфидных связей
2.4.3 Фолдинг и взаимодействие с шаперонами ЭПР
2.4.4 Транспорт FVIII из ЭПР в аппарат Гольджи
2.4.5 Процессинг FVIII в аппарате Гольджи
3. Фактор VIII в циркуляции
4. Взаимодействие FVIII с фактором 1Ха
5. Взаимодействие с фактором X
6. Взаимодействие с фосфолипидами
7. Активация FVIII и инактивация FVilla
8. Удаление FVIII из системной циркуляции
9. Полноразмерный рекомбинантный FVIII
10. Рекомбинантный FVIII с делецией В-домена
11. Факторы, ограничивающие продуктивность систем гетерологичной экспрессии
F VIII
12. Антитела к FVIII
13. Варианты FV1H пролонгированного действия
14. Системы гетерологичной экспрессии белков в клетках млекопитающих с высоким
выходом
Материалы и методы
1. Материалы и реактивы
2. Методы
2.1 Общие методы работы с бактериями Escherichia coli
2.2 Общие методы работы с ДНК
2.3 Создание экспрессионных конструкций
2.4 Препаративное получение плазмид для трансфекции
2.5 Ведение культур клеток млекопитающих

2.6 Трансфекция и селекция стабильно трансфицированных клеток
2.7 Создание моноклональных линий-продуцентов
2.8 ГТЦР в реальном времени
2.9 Саузерн-блот гибридизация
2.10 Иммуноферментный анализ
2.11 Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ)
2.12 Количественное определение белка
2.13 Иммуноблотинг
2.14 Получение мкАт
2.15 Коагулометрия
2.16 Компьютерное моделирование
2.17 Хроматографическая очистка ТУШ
2.18 Масс-спектрометрия
Результаты и обсуждение
1. Создание линии продуцента фактора VIII с делецией В-домена на базе стандартной экспрессионной системы
1.1 Создание экспрессионных конструкций делеционного мутанта ТУШ
1.2 Получение и характеризация линии-продуцента ВОО-ТУШ
2. Дизайн генетических элементов для оргинальной системы экспрессии р.1.
2.1 Получение минимального базового вектора рВІ
2.2 Получение фланкирующих областей гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка
2.3 Получение экспресс ионного вектора р. 1.
2.4 Проверка свойств вектора р1.1 и определение условий получения стабильно трансфицированных линий клеток и амплификации трансгена для модельного белка еСГР
3. Получение и характеризация линий-продуцентов ВОО-ТУШ на основе разработанной системы экспрессии
4. Разработка подходов к очистке рекомбинантного белка ВОО-ТУШ
4.1 Очистка и характеризация ВОО-ТУШ
4.2 Компьютерное моделирование, поиск синтетического лиганда для очистки
4.3 Получение моноклональных антител для иммуноаффинной очистки
Заключение
Выводы
Список литературы
Список иллюстраций
Список таблиц

Список сокращений
FVIII - фактор свертывания крови VIII;
FVIII BDD, BDD-FVIII — фактор VIII свертывания крови с делецией домена В;
FVIII BDD SQ - фактор VIII с делецией домена В вариант SQ;
BiP - immunoglobulin-binding protein; GRP78;
СНО - Chinese hamster ovary - клетки яичника китайского хомячка, Cricetulus griseus; CNX - кальнексин;
CRT - кальретикулин;
DHFR - дигидрофолатредуктаза [КФ 1.5.1.3]; dNTP - дезоксирибоинуклеотидтрифосфат;
EBV - вирус Эпштейна-Барр;
ELISA - метод твердофазного иммуноферментного анализа;
EMCV - вирус энцефаломиокардита;
ERAD - ER-associated degradation;
ERGIC - ER-Golgi intermediate compartment, промежуточный компартмент;
FIX — фактор свертывания крови IX;
GRP78 - glucose-regulated protein MW 78,000 иначе BiP;
GTI, GTII - глюкозидазы I и II;
FIAT среда - среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин;
НТ среда - среда, содержащая гипоксантин и тимидин;
IEX - ионообменная хроматография;
IRES — внутренний сайт связывания рибосом;
Ка - константа диссоциации;
Кт — константа Михаэлиса-Ментен;
МТХ - метотрексат;
PBS - фосфатно-буферизованный раствор;
SEC - гель-фильтрация (size exclusion chromatography);
TEMED - тетраэтилметилендиамин;
UGT- UDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase;
UPR - unfolded protein response;
Vmax — максимальная скоростьь ферментативной реакции;
АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время;
БСА — бычий сывороточный альбумин;

одновременном падении общего уровня экспрессии FVIII приблизительно вдвое [181]. Потери секретированного FVIII N0 на мембране продуцентов также могут быть уменьшены блокированием его взаимодействия с фосфатидилсерином при добавлении к культуральной среде ффВ, аннексина V или о-фосфо-Ь-серина [194].
12. Антитела к FVIII
У значительной части пациентов с гемофилией А наблюдается появление в кровотоке ингибиторов вводимого экзогенного VIII фактора свертываемости крови, блокирующих его прокоагуляционную активность [14]. Кроме того, известны случаи развития «приобретенной гемофилии А» у пациентов с нормальным геном FVIII за счет возникновения антител на аутологичный F VIII [195]. Этиология возникновения ингибиторных антител к FVIII на настоящий момент неясна. Ведутся обширные статистические исследования для выявления корреляций между возникновением ингибиторных антител и HLA-гаплотипом пациентов [196] или с характером мутации гена FVIII [197]. Среди ингибиторных антител преобладает класс IgG, в то же время антитела класса IgM составляют существенную часть общего титра [198]. Установлено, что аллоантитела связываются преимущественно с доменами А2 или С2 фактора VIII и препятствуют его взаимодействию с фактором FIX, тогда как аутоантитела связываются преимущественно с С2 доменом FVIII, что предположительно приводит к блокированию его взаимодействия с фосфолипидами и фактором фон Вилебрандта [199]. Кроме того, группа С. Кавери продемонстрировала, что аллоантитела к фактору VIII способны к его специфическому гидролизу [200]. При дальнейшем исследовании выборки больных гемофилией А с различными уровнями ингибитора была установлена корреляция между величиной протеолитической активности таких антител и уровнем ингибитора [201].
13. Варианты FVIII пролонгированного действия
Несмотря на то, что лекарственные препараты рекомбинантного FVIII значительно уменьшили потенциальный риск передачи вирусных инфекций, современная заместительная терапия гемофилии А остается весьма несовершенной и не обеспечивающей больным нормальное качество жизни. Основными ограничениями в ее эффективности является значительная иммуногенность FVIII, приводящая к появлению ингибиторных антител, и его короткое время полураспада, требующее проведения инъекций каждые 2-3 дня при профилактическом применении. Поскольку риск появления у больных ингибиторных антител к FV1II определяется, в том числе, числом проведенных