Структурно-функциональный анализ полисахарид-связывающего домена пероксидазы пшеницы

• Автор: Кузьмина, Ольга Ильинична
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 127 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Многообразие пероксидаз растений Ю

1.2. Структура белков с пероксидазной активностью

1.3. Функции пероксидаз в растениях

1.4. Участие пероксидаз в лигнификации и суберинизации клеточных 28 стенок

1.5. Пероксидазы в защите растений от патогенов

1.6. Сигнальная регуляция транскрипционной активности генов 34 пероксидаз

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 3

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Растительный материал 3
2.2. Бактериальные штаммы, плазмидные вектора, патоген
2.3. Реактивы
2.4. Составы использованных стандартных растворов
2.5. Олигонуклеотидные праймеры, использованные в ПЦР
2.6. Получение фрагмента гена пероксидазы, содержащего полисахарид- 42 специфичный домен
2.6.1. Выделение ДНК из растений
2.6.2. Измерение концентрации ДНК
2.6.3. Полимеразная цепная реакция нуклеиновых кислот
2.6.4. Электрофорез нуклеиновых кислот после ПЦР в ПААГ и агарозе
2.6.5. Секвенирование фрагмента гена пероксидазы
2.6.6. Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных 46 последовательностей
2.7. Получение химерного белка, содержащего полисахарид- 46 специфичный домен

2.7.1. Микробиологические среды
2.7.2. Подготовка компетентных клеток E. coli
2.7.3. Выделение плазмидной ДНК из E. coli
2.7.4. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами
2.7.5. Трансформация компетентных клеток E. coli плазмидной ДНК
2.7.6. Выделение тотального белка из E. coli ультразвуком и
последующая хроматография белков на хитине в объеме
2.7.7. Колориметрический метод определения белка по Бредфорду
2.7.8. Изоэлектрическое фокусирование белков
2.7.9. Электрофорез белков в денатурирующем 12% ПААТ
2.8. Получение трансгенных растений
2.8.1. Биобаллистическая трансформация каллусов пшеницы
2.8.2. Трансформация A. tumefaciens нлазмидными конструкциями
2.8.3. Обработка каллусов и семян пшеницы агробактериями, 52 содержащими генно-инженерные конструкции
2.8.4. Инфицирование растения пшеницы возбудителем септориоза
2.8.5. Оценка пораженности растений грибом S. nodorum
2.9. Статистическая обработка результатов
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 5
3.1. Сравнительный анализ связывающих полисахариды аминокислотных 55 последовательностей пероксидаз разных видов растений
3.2. ПЦР анализ фрагмента гена, кодирующего полисахарид- 62 связывающий домен анионной пероксидазы различных видов пшеницы и поиск гомологичных последовательностей
3.2.1. Оптимизация условий ПЦР с подобранными к генам полисахарид- 62 специфичных пероксидаз праймерами
3.2.2. Результаты ПЦР фрагмента гена пероксидазы, ответственного за 64 связывание с полисахаридами

3.3. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей 65 секвенированных фрагментов генов пероксидаз, кодиругоидих полисахарид-специфичный домен у разных видов пшеницы

3.4. Создание генно-инженерных конструкций со смысловой и антисмысловой ориентацией фрагмента гена анионной пероксИД331“1 пшеницы
V/ пд
3.4.1 Создание генно-инженерных конструкций со смысловой ориентацией полисахарид-связывающего сайта для изучения морфоло! о-физиологической роли пероксидазы в растениях
3.4.2 Создание генно-инженерных конструкций с антисмыс-ло^ой ^'
ориентацией полисахарид-связывающего сайта для изучения морфологофизиологической роли пероксидазы в растениях

3.4.3. Оптимизация параметров баллистической трансформации мяп-сои пшеницы
3.4.4. Оценка экспрессии 0145-гена в проростках пшеницы зтри
агробакгериальной трансформации
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

Вместе с тем механизм взаимодействия факторов регуляции транскрипции с ДНК-зависимыми РНК-полимеразами и промоторными участками генов ПО пока остаётся одной из слабо изученных проблем функционирования генома клеток. Особенно скудна информация, касающаяся регуляции экспрессии генов ПО. Только для 36 - 44 генов ПО А. thaliana, в зависимости от метода исследования, определены продукты транскрипционной активности как отдельные изоПО [Cosio, Dunand, 2009]. Восемь генов, характеризующихся неспецифическим и сравнительно высоким уровнем экспрессии, в промоторной зоне содержали г/ыс-элементы, чувствительные к гормонам и стрессовым воздействиям [Лебедева, 2003]. Например, в пяти из них обнаружены г/мс-элементы, чувствительные к ауксину (АСТТТА, CATATG, TGTCTC) [I.ee et al., 1999; Лебедева и др., 2003], тиббереллину (ТААСААА и ТТТТТТСС), АБК (AWTTCAAA). Уровень м-РНК ПО в растениях повышался при обработке абсцизовой, жасмоновой и салициловой кислотами [Crockard, 1999; Medina et al., 1999; Park et al., 2003; Moore et al., 2003; Ueeda et al., 2006]. У многих генов ПО выявлены цис-элементы (YTGTCWC), потенциально реагирующие на водный стресс, гипотермию или инфицирование. Предполагают, что экспрессия гена ПО у цуккини, кодирующего связывающуюся с пектином ПО, находится под контролем ауксинов [Carpin et al., 1999; Dunand et al., 2003]. Следует также заметить, что обнаруженьт взаимодействующие с ауксинами гомологичные мотивы а.п. белка АВР1 у ПО [Savitsky et al., 1999] и белков семейства термин [Napier et al., 2004]. На поверхности молекулы ПО этот сайт находится в составе дистального домена отдаленного от активного центра фермента и содержит в своем составе остаток аминокислоты Тгр-117 [Savitsky et al., 1999]. Семь генов ПО в растениях A. thaliana экспрессировались под воздействием Pseudomonas spp, три - в листьях при инфицировании грибами и два - насекомыми [Chassot et al., 2007; Little et al., 2007; Mohr, Cahill, 2007]. Три гена (AtP?vc21, AtPrx62, AtPrx71) индуцировались при инфицировании грибами [Chassot et al., 2007], при