Метаболическая инженерия штаммов Escherichia coli - биосенсоров, продуцентов цитокинов, факторов роста и низкомолекулярных веществ

• Автор: Птицын, Леонид Романович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 108 с. : ил.; 19х14 см

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ВВЕДЕНИЕ

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Конструирование рекомбинантных клеток E. coli - биосенсеров для анализа генотоксичности химических соединений и физических факторов

1.1. Клонирование фрагмента ДНК, кодирующего оперон биолюминесценции

P. leiognathi

1.2. Биолюминесцентный анализ SOS-ответа клеток E. coli

1.3. Индукция SOS-ответа под действием веществ - мутагенов (SOS lux тест)

1.4. Индукция SOS-ответа под действием UV или у-излучений

1.5. Анализ генотоксического действия комплексных соединений платины и сравнительная оценка их генотоксичности в эукариотической тест-системе
1.6. Возможности проведения SOS lux теста в полуавтоматическом варианте в
микропланшетах или использования иммобилизованных клеток в тест системе
Заключение
Глава 2. Экспрессия синтетических генов в клетках E. coli
2.1. Цитоплазматическая экспрессия синтетических генов в клетках E. coli
2.1.1. Модификации штаммов-продуцентов интерлейкина-3 и интерлейкина-4 человека.
2.1.2. Делеционная форма интерлейкина-4 человека -IL
2.1.3. Интерлейкин-10 человека - hIL-
2.1.4. Нейротрофин глиального происхождения человека - GDNF
2.1.5. Фактор роста кератиноцитов человека - hKGF
2.1.6. Рецепторный антагонист интерлейкина-1 человека -hlL-lra
2.1.7. у-интерферон быка - bIFN-y
2.2. Экстраклеточная продукция эпидермального фактора роста человека - hEGF
Заключение
Глава 3. Оптимизация ряда биосинтетических путей в клетках E. coli с целью
повышения продукции аминокислот
3.1 Модификация путей транспорта источников углерода с целью увеличения продукции аминокислот E. coli штаммами-продуцентами
3.2. Модификация аллостерической регуляции ключевых ферментов пути биосинтеза аргинина
3.3. Идентификация генов, кодирующих ферменты пути I деградации путресцина
(pathway: putrescine degradation I)
Заключение
Глава 4. Поиск новых низкомолекулярных биологически активных веществ растительного происхождения и возможность их микробиологического синтеза
4.1. Методы и тест-системы, использованные для скрининга этанольных экстрактов сухих растительных препаратов
4.2. Результаты скрининга этанольных экстрактов растительных препаратов
4.3. Идентификация новых соединений из экстрактов, активных в in vitro тестах.
4.4. Заключение. Потенциальная возможность микробиологического синтеза идентифицированных соединений
ВЫВОДЫ
Список публикаций по теме диссертации

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность проблемы.
Современная биотехнология, разрабатывающая и использующая генно-инженерные и клеточные методы создания генетически модифицированных биологических объектов для получения новых видов биологических и химических продуктов различного назначения и повышения эффективности их производства, возникла в 70-х гг. прошлого века. Развитие данных технологий на первых этапах было основано на манипуляциях in vitro с фрагментами ДНК из различных источников и/или синтетическими фрагментами ДНК, с последующим введением их в составе плазмид в живую клетку, где «искусственная» ДНК была способна реплицироваться, а кодируемая ею информация - экспрессироваться. В дальнейшем для повышения уровня продукции целевых соединений были разработаны методы целенаправленного и прецизионного внесения модификаций в бактериальный геном путем замены структурных и/или регуляторных областей биосинтетических генов, их внутрихромосомной амплификации и модуляции уровня экспрессии; делеции генов, контролирующих синтез нежелательных метаболических интермедиатов и побочных продуктов целевого биосинтеза; оптимизации клеточных систем потребления источников питания и систем секреции целевых продуктов и т.д.
Наглядными примерами успехов современной биотехнологии являются крупнотоннажное производство природных протеиногенных L-аминокислот, основанное на микробных продуцентах, создание новых эффективных лекарственных средств на основе низкомолекулярных биологически активных веществ и БАВ белковой природы -рекомбинантных гормонов и цитокинов.
Клетки Escherichia coli до сих пор являются одним из наиболее генетически и биохимически изученных микроорганизмов, что обусловливает их широкое применение как в биотехнологических исследованиях, так и в промышленности.
Настоящая диссертационная работа, представляемая в виде научного доклада, обобщает результаты исследований, посвященных: разработке биологических тест-систем (биосенсоров) на основе SOS-ответа клеток E. coli для оценки генотоксичности химических соединений и физических факторов; конструированию штаммов-продуцентов ряда цитокинов и факторов роста человека и других белков на основе бактерии E. coli; оптимизации ряда биосинтетических путей в клетках E. coli с целью повышения продукции аминокислот; поиску новых биологически активных низкомолекулярных веществ растительного происхождения, синтез которых может быть в будущем реализован микробиологическим путем.
Цели и задачи исследования.
Основная цель работы состояла в создании рекомбинантных штаммов E. coli, выполняющих функции биосенсоров для оценки генотоксичности, штаммов-продуцентов ряда белков (цитокинов и факторов роста) и низкомолекулярных соединений (аминокислот), и в поиске новых биологически активных низкомолекулярных веществ растительного происхождения, потенциальных объектов для микробиологического синтеза.
В соответствии с этим решались следующие задачи:
1. Конструирование рекомбинантных штаммов E. coli, несущих оперон биолюминесценции Photobacterium leiognathi под контролем индуцируемого SOS-системой E. coli промотора гена cda плазмиды ColD

от суммарного клеточного белка. Однако рост культуры существенно замедлялся уже через 2 ч после индукции биосинтеза гетерологичного белка, а через 3-4 ч наблюдался ее заметный лизис, что свидетельствовало о токсичности гетерологичного hIL-482 для клеток E. coli. Базальный уровень экспрессии в среднем не превышал 2% (рис. 10, дорожка 2), а удельное содержание целевого белка в очищенном препарате телец включения составляло 45-55% (рис. 10, дорожка 4).
По сравнению с pUCTIL-4d2, в плазмидах pBTIL-4d2 и pETIL-4d2 ген /»7-452 локализован под контролем более сильных промоторов РШс и Р77 ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7. Регуляция транскрипции в штаммах TGl(pBTIL-4d2) и BL21DE3(pETIL-4d2) была усилена введением тандема операторов Oiac (pBTIL-4d2) на фоне снижения копийности плазмиды (репликон pBR322) и генотипа lacl4 штамма TG1, или введением оператора Oiac непосредственно за промотором Р77 (pETIL-4d2) на фоне увеличения дозы гена lacl, входящего в состав вектора рЕТ22Ь(+), и Р/ас-зависимой транскрипции гена ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 в штамме BL21(DE3). Максимальная продукция hIL-452 для штаммов TGl(pBTIL-4d2) и BL21DE3(pETIL-4d2) составляла около 30% от общего клеточного белка через 2 ч с момента начала индукции (рис. 10). Таким образом, в обоих случаях удалось поднять продукцию целевого белка в полтора раза. Однако, базальный уровень экспрессии hIL-452 в штамме TGl(pBTIL-4d2) был в среднем в 2-3 раза выше, чем в штамме TGl(pUCTIL-4d2), что приводило к резкому
Рис. 10. Электрофореграммы препаратов суммарных белков штаммов-продуцентов hIL-452 и соответствующих им препаратов частично очищенных телец включения.
Дорожки: 1-маркер молекулярных весов; 2,5,8 - неиндуцированные штаммы TGl(pUCTIL-4d2),
BL21 DE3(pETIL-4d2), TGl(pBTIL-4d2) соответственно; 3,6,9 - индукция в течение 2 часов; 4, 7, 10 - тельца включения, частично очищенные неионным детергентом (TRITON X-100) в присутствии 0.5 М мочевины. Пунктирной рамкой выделены белковые зоны, соответствующие базальной продукции hIL-452 .
снижению стабильности штамма при хранении и культивировании. Возможно, это связано с неоптимизированной структурой тандема операторов 0/ас (центры двух операторных участков разделяют 15 п.н.), что не позволяет усилить репрессию промотора Р^с адекватно его «силе» на фоне эффективного RBS, даже несмотря на снижение копийности векторной плазмиды и генотип /ас/4 штамма TG1.
Напротив, штамм BL21DE3(pETIL-4d2) показывал наименьшую фоновую экспрессию hIL-482 (1-2%), был стабилен и имел наилучшие ростовые показатели. Благодаря особенности экспрессионных систем на основе ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 практически полностью переключать трансляционный аппарат
14кДа с;# ф :... ■ Ш ЧШ Ш ф