Исследование стабильности и РНК-связывающих свойств белка HFQ из Pseudomonas aeruginosa

• Автор: Мурина, Виктория Николаевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 126 с. : ил.

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Семейство Бш и Бт-подобных белков

Глава 2. Пространственная структура Бт/Бт-подобных белков

2.1. Первичная структура Бт-подобных белков

2.2. Четвертичная структура Бт/Бт-подобных белков

2.2.1. Белок АР-8т2 может быть гексамером и гептамером

2.2.2. Октамерный белок ЬятЗ

2.2.3. Бактериальные белки Hfq - гексамеры

2.2.4. Некоторые Бш-подобные белки эукариот существуют в виде мономеров

2.3. Динамика четвертичной структуры Бт/Бт-подобных белков
2.4. Образование фибрилл
Глава 3. Функции в клетке
3.1. Нй} имеет две РНК-связывающие поверхности
3.2. Взаимодействие Hfq с малыми регуляторными и матричными РНК
3.3. Взаимодействие Hfq с белками
3.4. Функции Hfq в нуклеоиде
ЧАСТЬ II. МЕТОДИЧЕСКАЯ
Глава 4. Материалы и методы
4.1. Методы генной инженерии и микробиологии
4.1.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле
4.1.2. Получение плазмид с необходимыми мутациями
4.1.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
4.1.4. Очистка фрагментов ДНК
4.1.5. Получение компетентных клеток
4.1.6. Трансформация клеток
4.1.7. Выделение плазмидной ДНК
4.2. Биохимические методы при работе с белками
4.2.1. Экспрессия генов Ыц дикого типа и его мутантных форм
4.2.2. Выделение белка Hfq дикого типа и его мутантных форм
4.2.3. Тепловая коагуляция термолабильных белков
4.2.4. Гидрофобная хроматография
4.2.5. Ионообменная хроматография
4.2.6. Аналитическая гель-фильтрация

4.2.7. Электрофорез белков в ПАЛГ в присутствии ДСН
4.2.8. Электрофорез белков в ПААГ в неденатурирующих условиях
4.2.9. Кристаллизация белков Ж’я
4.3. Определение стабильности белка Нй} дикого типа и его мутантных форм
4.3.1. Измерение спектров кругового дихроизма
4.3.2. Термофлуоресцентный анализ
4.3.3. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия
4.4. Определение и уточнение структур белков и комплексов белка Жя с нуклеотидами
ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 1. Получение генетических конструкций мутантных белков Жя
Глава 2. Выделение белка Жя дикого типа и его мутантных форм
Глава 3. Влияние произведенных замен на стабильность и олигомерное состояние белка Hfq
3.1. Влияние произведенных замен на стабильность вторичной структуры белка Жя
3.2. Влияние произведенных замен на экспонированность гидрофобных областей на поверхности белка
3.3. Влияние произведенных замен на стабильность мутантных белков
3.4. Влияние произведенных замен на олигомерное состояние белка Жя
Глава 4. Кристаллизация мутантных белков
4.1. Использование метода термофлуоресцентного анализа для поиска условий кристаллизации мутантных форм белка У55А, Б40А и УКНА/ПООТ РаеЖя
Глава 5. Определение структур белков Жя
Глава 6. Анализ полученных данных по стабильности и кристаллических структур
белков Жя
Глава 7. Проверка АТФазной активности белка
Глава 8. Кристаллизация препаратов Жя с рибонуклезидтрифосфатами
Глава 9. Определение структур полученных комплексов
9.1. Структура комплекса Ж} с АТФ и с его нерасщепляемым аналогом АОРМР..
9.2. Структура комплекса Жя с ЦТФ
9.3. Структура комплекса Жя с УТФ
9.4. Жя не формирует устойчивых комплексов с ГТФ
Глава 10. Сравнение полученных нами структур комплексов Жр-рибонуклезидтрифосфатов с известными структурами комплексов Жя-олигоРНК

Глава 11. Модель связывания белка Hfq с РНК
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

St Hf Sa Hfq/AUjG

Hissa

Рис. 21. Различия в положении сахарофосфатного остова в двух разных комплексах белка Hfq с U6 и AU5G РНК относительно центральной поры белка. (1) В структуре комплекса белка Hfq из Salmonella typhimurium свободные кислороды фосфатной группы ориентированы внутрь центральной полости, тогда как (2) в структуре комплекса Hfq из Staphilococcus aureus с AU5G РНК свободные кислороды фосфатной группы направлены, наоборот, к белку от центральной поры. (3) Свободные кислороды U6 РНК формируют водородные связи между собой через воду, что способствует закреплению их конформации в пространстве в данном положении и не формируют водородных связей с белком. (4) Свободные кислороды AU5G формируют водородные связи с остатком His58 через воду (Sauer and Weichenrieder, 2011, с изменениями).
Последняя из полученных на данный момент структур комплексов Hfq с У-богатыми РНК (Wang et al., 2011) показала, что связывание РНК на проксимальной