Характеристика ферментов системы рестрикции-модификации Eco29kl и их бифункционального гибридного варианта

• Автор: Мокрищева, Марина Леонидовна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 96 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Основные понятия о системах рестрикции-модификации
1.2. Номенклатура ферментов СРМ
1.3. Классификация СРМ
1.3.1. Системы рестрикции-модификации типа
1.3.2. Системы рестрикции-модификации типа II
1.3.3. Системы рестрикции-модификации типа
1.3.4. Системы рестрикции-модификации типа IV
1.4. Классификация ДНК-метилтрансфераз
1.4.1. Структура ДНК-метилтрансфераз
1.4.1.1. Структура большого домена ДНК-метилтрансфераз
1.4.1.2. Структура малого домена ДНК-метилтрансфераз
1.4.1.3. АбоМеСсвязывающий сайт ДНК-метилтрансфераз
1.4.2. Связывание и узнавание ДНК
1.5. Каталитические механизмы ДНК-метилтрансфераз
1.5.1. Каталитический механизм С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз
1.5.2. Каталитический механизм экзоциклических ДНК-метилтрансфераз
1.6. Разнообразие кинетических механизмов ДНК-метилтрансфераз
1.7. Выпетливание основания-мишени ДНК-метилтрансферазами
1.8. Требования ДНК-метилтрансфераз к ионам металлов
1.9. Система рестрикции-модификации Есо29к1
1.10. Пространственная структура эндонуклеазы Я. Есо29к1
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материалы
2.1.1. Штаммы бактерий, бактериофагов и плазмидные вектора
2.1.2. Материалы, реактивы и ферменты
2.2. Методы исследования
2.2.1. Общие, широко используемые методы
2.2.2. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.2.3. Конструирование плазмид и рекомбинантных штаммов
2.2.4. Получение бактериальной массы и экспрессия генов рекомбинантных белков

2.2.5. Выделение и очистка рекомбинантных белков
2.2.5.1. Очистка эндонуклеазы рестрикции 6№з-К..Есо29к1 в нативных условиях
2.2.5.2. Очистка эндонуклеазы рестрикции 6Н1з-11.Есо29к1 в денатурирующих условиях (восстановление из телец включения)
2.2.5.3. Очистка ДНК-метилтрансферазы 6ЕПз-М.Есо29к1
2.2.5.4. Очистка гибридного белка 6ЕНз-11М.Есо29к1
2.2.6. Тестирование эндонуклеазной активности ферментов 1СЕсо29к1,
6№з-11.Есо29к1 и 6ЕПз-КМ.Есо29к1
2.2.7. Определение оптимумов ферментативных реакций Я.Есо29к1,
6Шз-Г1.Есо29к1 и 6ЕПз-11М.Есо29к1
2.2.8. Тестирование метилтрансферазной активности ферментов
6№з-М.Есо29к1 и 6ЕПз-1Ш.Есо29к1
2.2.9. Определение сайта метилирования метилтрансферазы 6Шз-М.Есо29к1
2.2.10. Кинетические исследования ферментативной активности 6Н1з-М.Есо29к1
2.2.10.1. Зависимость начальных скоростей реакций М.Есо29к1 от ДНК и А<1оМе1
2.2.10.2. Ингибирование ферментативной активности 6Н1з-М.Есо29к1 субстратами
2.2.10.3. Предварительная инкубация фермента с субстратами
2.2.10.4. Метод разделения изотопов
2.2.11. Анализ влияния Ас1оМе1 на эндонуклеазную активность 6Н1з-11М.Есо29к1
2.2.12. Анализ ограничения роста бактериофага А, системой
рестрикции-модификации ЯМ.Есо29к1 методом «спот-теста»
2.2.13. Измерение концентрации белка
2.2.14. Измерение 3Н-меченых препаратов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Изучение свойств эндонуклеазы рестрикции 6Н1з-11.Есо29к1
3.1.1. Конструирование штамма с повышенным синтезом эндонуклеазы 6Н1з-1ТЕсо29к1
3.1.2. Очистка эндонуклеазы 6ЕПз-11.Есо29к1 в нативных условиях
3.1.3. Очистка эндонуклеазы 6Н1з-11.Есо29к1 в денатурирующих условиях
3.1.4. Сравнение биохимических свойств нативного белка Я.Есо29к1 и его бЕПэ-производного
3.2. Изучение свойств ДНК-метилтрансферазы 6ЕПз-М.Есо29к1
3.2.1. Конструирование штамма с повышенным синтезом ДНК-метилтрансферазы 6Н1з-М.Есо29к1 и очистка белка
3.2.2. Биохимическая характеристика ДНК-метилтрансферазы 6Н1з-М.Есо29к1

и определение сайта метилирования
3.2.3. Влияние концентрации субстратов, ДНК и AdoMet, на начальные скорости реакции ДНК-метилтрансферазы 6His-M.Eco29kI
3.2.4. Порядок связывания субстратов ДНК-метилтрансферазой 6His-M.Eco29kI
3.3. Конструирование бифункционального гибридного белка, несущего эндонуклеазную и метилтрансферазную активности СРМ Eco29kI, и изучение его свойств
3.3.1. Конструирование штамма с повышенным синтезом бифункционального фермента RM.Eco29kI и очистка гибридного белка
3.3.2. Тестирование эндонуклеазной активности гибридного белка 6His-RM.Eco29kI
3.3.3. Тестирование метилтрансферазной активности гибридного белка 6His-RM.Eco29kI
3.3.4. Характеристика функциональной активности гибридной
СРМ RM.Eco29kI in vivo
3.3.5. Характеристика функциональной активности гибридного
белка RM.Eco29kI in vitro
3.3.6. Номенклатура нового гибридного фермента RM.Eco29kI
3.3.7. Роль слияния генов в эволюции систем рестрикции-модификации
3.3.8. Применение искусственного слияния генов для получения эндонуклеаз
с новыми специфичностями
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

других авторов (Klimasauskas and Roberts, 1995) было показано, что M.Hhal может образовывать прочные комплексы с ДНК, содержащей в положении цитозина-мишени аденин, гуанин, тимин или урацил. Эффективность связывания ферментом таких аналогов сайта-мишени находится в обратной зависимости (С < G, А < Т, U) от стабильности пар указанных оснований с гуанином (С » G,A,T). Их стабильность оценивали по температуре плавления ДНК-дуплексов. Это объясняется тем, что фермент связывается с ДНК тем прочнее, чем меньше энергии нужно затратить на разрушение водородной связи выпетливаемого основания с гуанином. При взаимодействии M.Hhal с ДНК, содержащей вместо метилируемого цитозина флуоресцентный аналог аденина, 2-аминопурин (2АР), происходит значительное увеличение флуоресценции этого основания (Holz et al., 1998). В составе спирали ДНК флуоресценция 2-аминопурина гасится вследствие стэкинг-взаимодействий с соседними основаниями (Xu et al., 1994). Резкое увеличение флуоресценции при добавлении M.Hhal свидетельствует о выпетливании пуринового основания из состава ДНК в результате связывания с ферментом (Holz et al., 1998). В настоящее время ДНК-дуплексы, содержащие 2-аминопурин в позиции основания-мишени, широко используются для изучения процесса выпетливания основания-мишени из двойной спирали различными ДНК-метилтрансферазами (Vilkaitis et al., 2000).
В M.Hhal одновременно с выпетливанием метилируемого цитозина происходят значительные конформационные изменения самого фермента. Сравнение структур M.Hhal-AdoMet двойного и M.Hhal-flHK-AdoHcy тройного комплексов показало, что при связывании ДНК каталитическая петля фермента (81-100 а.о.), содержащая инвариантный остаток Cys81, сдвигается примерно на 26 А в сторону ДНК-связывающей полости и образует контакты с малой бороздкой ДНК (Рис. 8; Youngblood et al., 2006). Таким образом, происходит переход петли из «открытой» в «закрытую» конформацию. Также для малого домена M.Hhal наблюдался небольшой сдвиг в сторону ДНК-связывающей полости. Интересно, что такая перестройка в ферменте происходит только при связывании ДНК, содержащей канонический участок узнавания, и не наблюдается при образовании комплексов с неспецифической ДНК (Estabrook et al., 2006). Согласно предложенной модели предполагается, что M.Hhal «скользит» вдоль ДНК с открытой каталитической петлей до встречи со своим участком узнавания, затем фермент мгновенно выпетливает цитозин из двойной спирали и «замыкает» каталитическую петлю (Vilkaitis et al., 2001; Estabrook et al., 2006).
При изучении ДНК-метилтрансферазы M.Taql методом флуоресцентной спектроскопии (Holz et al., 1998) было показано, что при ее взаимодействии с олигонуклеотидным дуплексом, содержащим 2-АР модификацию основания-мишени,