Поиск эффективных мишеней РНК-интерференции в транскриптах ВИЧ-1 и разработка нового метода создания кассетных генетических конструкций, экспрессирующих несколько siPHK

• Автор: Алембеков, Ильдар Русланович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1 Актуальность проблемы

1.2 Цель и задачи исследования

1.3 Научная новизна результатов исследования

1.4 Практическая ценность

1.5 Апробация работы

1.6 Структура и объем работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 РНК интерференция

2.1.1 Современные представления о механизме РНК-интерференции

2.1.2 Малые и длинные некодирующие РНК
2.1.3 Биогенез малых РНК
2.1.4 Сборка комплекса РНК-сайленсинга
2.1.5 Расщепление мРНК-мишени и трансляционная репрессия
2.1.6 Регуляция РНК-интерференции
2.2. Биология ВИЧ-
2.2.1 Строение ВИЧ-
2.2.2 Жизненный цикл ВИЧ-
2.3 Использование РНК интерференции в терапии СПИДа
2.3.1. Основные принципы разрабатываемой генотерапии с использованием генетических конструкций, запускающих РНК-интерференцию
2.3.2 Поиск мишеней в геноме ВИЧ-1 для РНК интерференции
2.3.3 Доставка генетических конструкций в организм
2.3.4 Неспецифические эффекты терапии с использованием РНК-интерференции
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Биологические материалы
3.1.1. Используемые векторы
3.1.2. Олигонуклеотиды
3.1.3. Культуры клеток

3.2. Создание генетических конструкций
3.2.1. Вставки для экспересии отдельных ь1РНК и вставки-домены
3.2.2. Кассетные вставки
3.2.3. Клонирование
3.3. Испытание созданных конструкций в невирусной системе
3.3.1. Очистка и нормализация препаратов плазмидной ДНК
3.3.2. Трансфекция
3.3.3. Измерение люминесценции люцифераз
3.4 Выделение тотальной РНК
3.5 Детекция б1РНК методом защиты от РНКазы
3.4.1. Приготовление меченной РНК
3.4.3 Детекция в1РНК
3.6 Детекция активации интерферон-зависимого ответа методом ОТ-ПЦР
3.6.1 Синтез кДНК
3.6.2 Праймер-специфичная амплификация
3.7. Испытание генетических конструкций в псевдолентивирусной системе
3.7.1. Получение рекомбинантных псевдолентивирусов и подавление их продукции интерферирующими РНК
3.7.2. Определение вирусного титра и эффективности ингибирования продукции лентивирусов с помощью анти-ВИЧ яНША
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1 Выбор мишеней РНК-интерференции в геноме ВИЧ-
4.2 Эффективность РНК-интерференции, вызываемой генетической конструкцией, зависит от силы промотора
4.3 Генетические конструкции, экспрессирующие удлинённые шпильки, запускают более эффективную РНК-интерференцию
4.4 Новый метод создания кассетных генетических конст рукций с использованием олигонуклеотидов, не образующих шпильки
4.5 Испытание кассетных генетических конструкций, экспрессирующих несколько б1РНК, в невирусной системе
4.6 Испытание генетических конструкций, экспрессирующих я1РНК, в псевдолентивирус-клеточной системе

4.6.1 Расположение и структура сайтов-мишепей для анти-ВИЧ siPHK в последовательностях транскриптов системы лентивирусной экспрессии in vitro..
4.6.2 Подавление продукции псевдолентивирусов в клетках линии НЕК-293Т путем коэкспрессии siPHK, направленных против разных мишеней в лентивируспом геноме
4.7 Генетические конструкции, экспрессирующие siPHK, не вызывают активации неспецифического интерферон-зависимого ответа
4.7.1 Анализ возможной активации интерферонового пути
4.7.2 Гены, использованные в детекции активации интерферонового пути
4.7.3 Вариабельность неспецифического интерферонового ответа
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

lipid hi layer
ташЬшж
(I) Resting Configuration
(2) CD4 Coreceptor Binding
(3) Insertion of I* us wo Peptide into Target Btlaycr (4) Formation of Six-Helix Bundle Membrane Fusion
helix [x:N helix union peptide
bundle
Рисунок 6 Этапы слияния мембран вириона и клетки-хозяина, индуцируемые F.nv ВИЧ-
1. (1) gpl20/gp41 комплекс в неактивной конфигурации до взаимодействия с CD4 и корецептором. (2) gpl 20 связывается с CD4 и корецептором, стимулируя конформационные изменения в gp 1 20 и gp41. (3) эктодомен gp41 адоптируется к удлиненной конформации, фьюжен белок на N-конце gp41 встраивается в билипидный слой клетки. (4) N и С-спирали эктодомена gp41 сворачиваются в устойчивую конформацию из шести спиралей, сближая мембраны (Freed et al., 2001).
Интересно отметить, что некоторые линии ВИЧ способны связываться с корецептором и инфицировать клетки при отсутствии CD4 (Endres et al., 1996). То есть gpl20 в этих линиях ВИЧ постоянно пребывает в активной конформации. Важная роль корецепторов была продемонстрирована в многочисленных исследованиях in vivo. В частности, генетическая гетерогенность аллелей корецепторов может влиять на восприимчивость индивидуума к ВИЧ инфекции, или влиять на клиническую картину развития сопутствующих заболеваний. Например, при мутации ССЯ5/Д32. приводящей к образованию укороченной формы CCR5, у гомозиготных индивидуумов, несущих аллель данной мутации, наблюдается устойчивость к инфицированию ВИЧ (Dean et al., 1996). То есть корецепторы могут быть одной из эффективных мишеней для антивирусной терапии.