Молекулярно-генетическая характеристика экспортера ароматических аминокислот YddG Escherichia Coli

• Автор: Цыренжапова, Ирина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 106 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ ,

Актуальность проблемы

Цель и задачи исследования

Научная новизна и практическая ценность работы

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПОРТЕРОВ АМИНОКИСЛОТ Escherichia coli И Corynebacterium glutamicwn

1Л. Обзор известных экспортеров аминокислот

1.2. Гены экспортеров аминокислот и их регуляция

1.2Л. Экспортеры аминокислот Corynebacterium glutamicwn

1.2 Л Л. Экспортер лизина и аргинина LysE
1.2Л .2. Экспортер треонина и серина ThrE
1.2.1.3. Экспортер гидрофобных аминокислот BmFE
1.2.2. Экспортеры аминокислот Escherichia coli
1.2.2.1. Экспортеры гомосерина и треонина RhtB. RhtC и RhtA
1.2.2.2. Экспортеры О-ацетилсерина и L-цистеина YdcD и YfiK
1.2.2.3. Экспортер L-аргинина ArgO
1.2.2.4. Экспортер L-лейцина LeuE
1.2.2.5. Экспортер L-валина YgaZH
1.2.2.6. Экспортер ароматических аминокислот YddG
2. ЭКСПОРТЕРЫ АМИНОКИСЛОТ - ИНТЕГРАЛЬНЫЕ МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ
2.1. Классификация интегральных мембранных белков.;
2.2. Биогенез мембранных белков
2.2.1. Интеграция мембранных белков с помощью Sec-системы зависит от SRP частицы
2.2.2. Sec-транслокон
2.2.3. YidC- зависимая интеграция мембранных белков
2.3. Исследования интегральных мембранных белков
2.3.1. Предсказание интегральных мембранных белков на основании анализа аминокислотной последовательности
2.3.2. Экспериментальные подходы к определению топологии интегральных мембранных белков

2.3.2.1. Использование гибридов с репортерными белками
2.3.2.2. Использование специфических последовательностей в качестве репортерных
2.3.2.3. Метод сайт-специфического мечения остатков цистеина
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Бактериальные штаммы, среды и условия культивирования
2. Определение устойчивости клеток TGI (jpBRyddG '-ЫаМ) к ампициллину
3. Условия культивирования и определение фенилаланина в культуральной жидкости
4. Проведение ПЦР
5. Генно-инженерные методики
6. Конструирование штаммов
7. Конструирование рекомбинантных плазмид
8. Получение рекомбинантных плазмид pBRyddG’-blaM, содержащих укороченный ген yddG, с помощью экзонуклеазы III
9. Выделение РНК
10. Определение стартовой точки транскрипции
11. ГЩР, сопряженная с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)
12. Определение ферментативных активностей
12.1. Определение активности р-галактозидазы
12.2. Определение активности щелочной фосфатазы
12.3. Определение активности ДАГФ-синтазы
13. Измерение флуоресценции
14. Выделение мембранных белков
15. Иммуноблоттинг
16. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. ИЗУЧЕНИЕ РЕГУЛЯЦИИ ГЕНА yddG
1.1. Картирование промотора гена yddG
1.2. Получение гена гибридного белка YddG-LacZ в хромосоме Е. coli
1.3. Активность промотора yddG in vivo при росте штамма MG 1655AlacZyddG ’-IcicZ на лабораторных средах LB и М
1.4. Экспрессия yddG при росте MG1655 tlacZyddG'-lacZ в присутствии метилвиологена
1.5. Изучение влияния глобального регулятора Lip на экспрессию yddG’-lacZ
1.6. Изучение влияния «катаболитной активации» на экспрессию yddG ’-lacZ
1.7. Экспрессия ydeiG при роете MG1655 AlacZyddG ’-lacZ в присутствии некоторых аминокислот
1.8. Изучение влияния TyrR на экспрессию yddG ’-lacZ
1.9. Влияние скорости роста клеток на активность промотора yddG
1.10. ЭкспрессияyddG’-lacZв штаммах RpoS1 и RpoS'
2. СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ YddG КАК ИНТЕГРАЛЬНОГО МЕМБРАННОГО БЕЛКА
2.1. Топологическая модель YddG, предлагаемая в экспериментах in silico
2.2. Конструирование и анализyddG’-ЫаМгибридов
2.3. Иммунодетекция YddG-BlaM гибридов
2.4. Конструирование и анализ YddG’-ZsGreen гибридов
2.5. Иммунодетекция YddG-ZsGreen гибридов
2.6. Определение внутриклеточной локализации YddG-ZsGreen гибридов
2.7 Сравнительный анализ YddG и транспортеров DME семейства
3. ВЛИЯНИЕ СВЕРХЭКСПРЕССИИ yddG НА ПРОДУКЦИЮ ФЕНИЛАЛАНИНА
3.1. Замена регуляторной области тепл yddG
3.2. Эффект сверхэкспрессии yddG в штаммах-продуцентах на продукцию фенилаланина
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Таблица 2.3. Экспортеры E. coli с известной пространственной структурой
Транспортер Суперсемейство Количество ТМ доменов Комплекс Сообщаемая устойчивость
AcrB (Multidrug resistance efflux pump)(2.A.6.2.2) RND (Rcsistance- Nodulation- Division) 12 AcrAB-TolC Расворнтели, ' краски, детергентам, липофильным антибиотикам (новобиоцин, эритромицин и др.)
EmrE(Small multidrug efflux pump)(2.A.7.1.3) DMT (Drug/Metabolite Transporter family) 5 Этидиум, метилвиологен, тетрациклин, эритромицин, акрифлавин и др.
EmrD (Multidrug efflux protein) (2.A 1 2.9) MFS (Major Facilitator Superfamily) 12 СССР, тетрахлоросалицил анилид
Топология политопических. мембранных белков определяется «правилом положительного заряда» (positive inside rule), согласно которому гидрофильные петли, расположенные в цитоплазме, обогащены, положительно заряженными аминокислотами {von Heijne, 1988). Двойная топология, белка EmrE объясняется слабовыраженным* «правилом положительного заряда» в его аминокислотной последовательности и-поэтому принимаемая этим белком в процессе интеграции ориентация в мембране носит произвольный характер. Таким образом, функционально активный экспортер представляет собой гомодимер, состоящий из двух антипараллельных субъединиц. Предположительно, топология интегральных белков принимается в процессе котрансляциопной интеграции белка в мембрану и сохраняется в процессе функционирования. Однако, искусственно можно, изменить топологию белка, изменяя фосфолипидный состав мембран {Bogdanov et al, 2002; Wang et al., 2002; Zhang et al., 2003). Так, показано, что LacY, состоящий из 12 ТМ сегментов, может менять ориентацию первых 6 ТМ сегментов с N-конца в зависимости от присутствия фосфатидилэтаноламина в мембранах {Bogdanov et al., 2002).
2.3.1. Предсказание интегральных мембранных белков на основании анализа аминокислотной последовательности
При отсутствии экспериментальных данных широко используются программы, предсказывающие топологию мембранных белков на основании анализа аминокислотной, последовательности. ТМ сегменты таких белков идентифицируют по наличию