Активность ретроэлементов в нейрональных тканях взрослого организма

• Автор: Курносов, Алексей Анатольевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 103 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Влияние ретроэлементов на структуру генома
2.2. Функциональные последствия инсерций ретроэлементов
2.3. Транспозиционная активность мобильных элементов в соматических клетках
2.4. Ретроэлементы и мозг
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выбор образцов для исследования
3.2. Использование метода супрессионной ПЦР для создания полногеномных библиотек фланкирующих последовательностей ретроэлементов
3.3. Биоинформатический анализ данных секвенирования фланкирующих последовательностей ретроэлементов
3.4. Общая характеристика полученных библиотек фланкирующих последовательностей ретроэлементов
3.5. Валидация потенциальных соматических инсерций ретроэлементов
3.6. Амплификация валидированных соматических инсерций с
геномной ДНК в качестве матрицы
3.7. Оценка специфичности метода получения библиотек фланкирующих последовательностей ретроэлементов
3.8. Оценка эффективности метода получения библиотек фланкирующих последовательностей ретроэлементов
3.9. Анализ распределения соматических инсерций ретроэлементов
в анализируемых образцах тканей
3.10. Анализ геномного распределения соматических инсерций
3.11. Анализ ориентации соматических инсерций ретроэлементов относительно расположенных рядом генов

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
4.1. Материалы
4.2. Методы
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
LTR (Long Terminal Repeat) - длинный концевой повтор
LINE, (Long Interspersed Element) - длинный диспергированный повтор.
SINE (Short Interspersed Element) - короткий диспергированный повтор ORF1 (Open Reading Frame-1) - открытая рамка считывания 1 ORF2 (Open Reading Frame-2) - открытая рамка считывания 2 5’UTR (5’-Untranslated Region) - 5’-нетранслируемая область 3’UTR (3’-Untranslated Region) - З’-нетранслируемая область TSD (Target Site Duplication) - дупликация сайта мишени SVA (SINE, VNTR, AIu)
HGP (Human Genome Project) - проект Геном Человека HuRef (Human Reference)
TCF (Transcription Factor) - транскрипционный фактор LEF (Lymphoid enhancer-binding factor)
Sox2 (SRY (sex determining region Y)-box 2)
EGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) - зеленый флуоресцентный белок CMV (Cytomegalovirus) — цитомегаловирус
NPC (Neural Progenitor Cells) - клетки-предшественники нейронов
HCN (hippocampus neural stem cells) - нейрональные стволовые клетки гиппокампа
МеСР2 (methyl CpG binding protein 2)

3.2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА СУПРЕССИОННОЙ ПЦР ДЛЯ СОЗДАНИЯ ПОЛНОГЕНОМНЫХ БИБЛИОТЕК ФЛАНКИРУЮЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ РЕТРОЭЛЕМЕНТОВ
Одной из основных сложностей в картировании последовательностей известных ретроэлементов является низкая степень вариабельности их первичной структуры. В то же время, знание структуры не дает никакой информации о положении в геноме ранее не идентифицировавшихся инсерций. Поэтому как для картирования ранее известных мобильных элементов, так и для определения новых точек интеграций необходимо знание структуры уникальных последовательностей, фланкирующих ретроэлемент. Информация об этих последовательностях может быть получена с помощью полного секвенирования ДНК каждой клетки исследуемого образца, однако такая процедура является слишком дорогостоящей, а ее применение для поиска редких молекул, представляющих уникальные ретротранспозиционные события в соматических клетках, невозможно даже на современном уровне развития технологий секвенирования. Поэтому альтернативой полного секвенирования генома является секвенирование последовательностей ретроэлементов (или их фрагментов) и прилегающих к ним участков, служащих для идентификации расположения ретроэлемента в геноме.
Для получения библиотек фланкирующих последовательностей ретроэлементов был модифицирован метод, основанный на супрессионной ПЦР, ранее использовавшийся для поиска полиморфных мобильных элементов [16, 118]. На первом этапе подготовки библиотеки геномная ДНК гидролизуется эндонуклеазами рестрикции, узнающими тетрануклеотидные последовательности ДНК (рис. 8 а). Для проводимой в дальнейшем супрессионной ПЦР и подготовительных этапов секвенирования (мостиковой амплификации) важно, чтобы длина молекул, содержащих фрагмент ретроэлемента и его фланкирующую последовательность, находилась в пределах 150 - 700 п.о. Средняя длина молекул, полученных с помощью используемых в данной работе рестриктаз, находится в этих пределах, что позволяет добиться высокой представленности имеющихся в геноме ретроэлементов в полученной библиотеке. Кроме того, независимое использование двух эндонуклеаз рестрикции для каждого из образцов ДНК повышает число фланков ретроэлементов, входящих в получаемую библиотеку.