Роль основного стрессового белка млекопитающих (БТШ70) в защите миелоидных клеток от действия бактериального эндотоксина

• Автор: Рожкова, Елена Александровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Определение и эпидемиология сепсиса
1.2. Клетки врожденной иммунной системы и пути их взаимодействия с патогенами
1.3. Липополисахарид грамотрицательных бактерий и его роль в развитии сепсиса
1.3.1. Строение молекулы липополисахарида и его формы
1.3.2. Взаимодействие бактериального эндотоксина с рецепторами клеток врожденной иммунной системы
1.3.3. Сигнальные каскады, запускаемые после узнавания ЛПС
1.4. Характеристика семейства БТШ
1.5. Использование БТШ70 в медицине
1.6. Роль БТШ70 при воспалении и эндотоксемии
1.6.1. Действие эндогенного внутриклеточного БТШ70 при воспалении
1.6.2. Действие внеклеточного БТШ70 при воспалении
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования
2.1.1. Выделение нейтрофилов из периферической крови человека
2.1.1.1. Определение жизнеспособности нейтрофилов
2.1.1.2. Морфологический контроль клеток
2.1.2. Ведение культуры клеток мышиных макрофагов 1
2.1.3. Содержание животных
2.2. Методы исследования
2.2.1. Выделение белков
2.2.1.1. Выделение БТШ70 из сердечной мышцы верблюда
2.2.1.2. Экспрессия и очистка рекомбинантного БТШ
2.2.2. Регистрация образования АФК нейтрофилами с помощью хемилюминесцентного метода
2.2.3. Регистрация апоптоза нейтрофилов
2.2.3.1. Культивирование нейтрофилов для определения апоптоза
2.2.3.2. Окрашивание клеток флуоресцентным зондом НоесЬз1-33
2.2.4. Регистрация экспрессии р2-интегриновых рецепторов нейтрофилов
2.2.5. Измерение продукции оксида азота макрофагами (1774)
2.2.6. Диск-электрофорез белков в ПААГ с ДДС-Ла (по Лэммли)
2.2.6.1. Окрашивание гелей «Кумасси 11-250»
2.2.7. Двумерный электрофорез белков по О’Фарреллу
2.2.7.1.Подготовка проб к двумерному электрофорезу
2.2.7.2. Включение 358-мстионина в белки
22.13. Двумерное разделение белков в ПААГ
2.2.7.4. Идентификация белков методом пептидного фингерпринта
2.2.7.5. Подсчёт общего включения 358-метионина в белки
2.2.8. Моделирование экспериментального грамотрицательного сепсиса у крыс.
2.2.9. Определение шаперонной активности БТШ70 методом ИФА
2.2.10. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Исследование влияния рБТШ70 на выживаемость крыс в модели экспериментального грамотрицательного сепсиса
3.2. Сравнение шаперонной активности БТШ70 млекопитающих из разных объектов .
3.3. Прекондиционирование с БТШ70 ослабляет ЛПС-индуцированный воспалительный ответ на клеточном уровне
3.4. Прекондиционирование с БТШ70 значительно модифицирует ЛПС-индуцированную экспрессию Рг-интегриновых рецепторов нейтрофилов
3.5. Предварительная обработка БТШ70 частично нормализует апоптоз нейтрофилов.
3.6. Прекондиционирование с препаратами БТШ70 ингибирует продукцию N
3.7. Повышение температуры (ТШ) и экзогенный БТШ70 сходньм образом ингибируют ЛПС-индуцированную продукцию N
3.8. Анализ протеома клеток 1774 при комбинированной обработке рБТШ70, ЛПС и

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

Список сокращений
АР-1 — транскрипционный фактор (с англ. activator protein 1)
CD - дифференцировочные антигены лейкоцитов
CD 14 - дифференцировочный антиген моноцитов и макрофагов
ERK — внеклеточные сигнал-регулируемые киназы (с англ. extracellular signal-regulated kinase)
FITC - флуоресцеинизотиоцианат
fMLP - формил-метионил-лейцил-фенилаланин
Grp — глюкозо-регулируемые белки (с англ. glucose regulated proteins)
HBSS - раствор Хэнкса IKK — 1кВ киназа IL - интерлейкины INF - интерфероны
iNOS - индуцибельная форма синтазы оксида азота 1кВ - ингибиторы кВ
JNK — c-jun NH2-терминальные киназы (с англ. c-Jun N-terminal kinase)
LBP - липополисахарид-связывающий белок (с англ. lipopolysaccharide binding protein) MAMPs - микробоассоциированные молекулярные паттерны
МАРК - митоген-активируемая протеинкиназа (с англ. mitogen-activated protein kinase) MD2 — миелоидный белок дифференциации
MyD88 - миелоидный дифференцировочный фактор 88 (с англ. myeloid differentiation primary response gene 88)
NF-кВ - ядерпый фактор транскрипции «каппа-би» (с англ. nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells)
NK - естественные киллерные клетки (с англ. natural killer)
NO - оксид (окись) азота
PAMPs - патогенассоциированные молекулярные паттерны (с англ. pathogen-associated molecular patterns)
PBS — фосфатный буфер
PRRs - паттернраспознающие рецепторы (с англ. pattern recognition receptors)
SAPK - стресс-активируемые протеинкиназы ( с англ. stress-activated protein kinase) TEMED - тетраметилэтилендиамин
TIR- Toll-интерлейкин-1-рецепторный домен (с англ. Toll-interleukin-1 receptor)
связанных с ним пептидов (Blachere et al., 1993; Pierce, 1994). На основе этой модели были созданы вакцины. Фирмы, производящие такие вакцины, сообщают о ремиссии у 70 — 80% больных (Гужова и др., 2005).
В настоящее время достоверно показано, что необычная локализация БТШ70 на мембранах опухолевых клеток, в отличие от соседних нормальных клеток, может служить в качестве специфичной для опухоли структуры, распознаваемой NK-клетками (Radons and Multhoff, 2005). Связанный с мембраной, а также свободный БТШ70 может непосредственно активировать цитотоксическую и миграционную способность NK-клеток. Показано, что экзогенный БТШ70 непосредственно интернализуется NK-клетками и усиливает продукцию y-INF у стимулированных цитокинами клеток (Коваленко и др., 2006). Опухолевые клетки и АПК активно продуцируют БТШ70 на поверхность и в межклеточное пространство в составе экзосом (Stoorvogel et al., 2002). Такие БТШ70 служат сигналом опасности. Внеклеточный БТШ70 узнается целым рядом иммунных рецепторов - и способен усиливать хемотаксис, фагоцитоз, цитолитическую активность клеток врожденного, иммунитета и стимулировать антигенспецифичный ответ (Radons and Multhoff, 2005). Таким образом, внеклеточный БТШ70 является позитивным, регулятором иммунного ответа.
Известно также участие БТШ70 и в аутоиммунных заболеваниях. Бактериальный БТШ70 обладает высоко иммуногенными свойствами, индуцируя продукцию антител и активацию Т-клеток. Анти-БТШ70 антитела и Т-клетки могут повреждать ткани и служить причиной воспалительной реакции. Так, БТЩ70 вовлечен- в патогенез целого ряда аутоиммунных заболеваний, таких, как диабет I типа, болезнь Крона, атеросклероз и ювенальный хронический артрит (Tsan and Gao, 2004b). Но в настоящее время в ряде работ показано, что предварительная стимуляция иммунитета к собственному БТШ70, с использованием бактериального БТШ70 или его консервативных пептидов; имеет большое значение в профилактике и терапии аутоиммунных заболеваний (Raska and Weigl, 2005).
Повышение уровня БТШ70 в клетках способно предохранять их от ишемии и других повреждений, а также способствовать, уменьшению воспаления и заживлению ран. Экспериментальные и клинические данные свидетельствуют в пользу того, что индуцибельный БТШ70 является ключевым регулятором эндогенных путей, лимитирующих область поражения миокарда при инфаркте и операциях на сердце (Lepore et al., 2001). Кроме того, показано, что при