Иммунобарназные конъюгаты для диагностики и терапии рака

• Автор: Эдельвейс, Эвелина Федоровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 196 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Разработка терапевтических средств, направленных на 9 ТИРОЗИНКИНАЗНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ EGFR и ERBB2

1.1.1 Общие сведения о тирозинкиназных рецепторах

1.1.2 Разработка антител, направленных на EGFR и ERBB2

1.2 Антитела для направленной доставки токсинов к з 2 опухолям

1.3 Использование рибонуклеаз для создания 41 противоопухолевых средств

1.3.1 Рибонуклеазы как противоопухолевые агенты

1.3.2 Механизмы цитотоксического действия рибонуклеаз

1.3.3 Причины избирательного действия рибонуклеаз на 49 опухолевые клетки
1.3.4 Рибонуклеазы, чувствительные к ингибитору рибонуклеаз
1.3.4.1 Бычья панкреатическая РНКаза А
1.3.4.2 Человеческие рибонуклеазы
1.3.5 Рибонуклеазы, нечувствительные к ингибитору рибонуклеаз
1.3.5.1 Рибонуклеазы земноводных
1.3.5.2 РНКаза из семенников быка
1.3.5.3 Бактериальные рибонуклеазы
2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Получение барназы и иммунобарназных конъюгатов и 88 их анализ in vitro
3.1.1 Получение рекомбинантных белков в E.coli gg
3.1.2 Рибонуклеазная активность барназы и иммунобарназных 91 конъюгатов
3.2 Взаимодействие барназы с клетками
3.2.1 Связывание барназы с клетками
3.2.2 Интернализация барназы клетками
3.3 Взаимодействие иммунобарназных конъюгатов с
КЛЕТКАМИ
3.3.1 Иммуноцитохимический анализ уровня рецептора ERBB2 на 96 клетках
3.3.2 Связывание иммунобарназных конъюгатов с клетками 96 (флуоресцентная микроскопия и проточная цитометрия)
3.3.3 Взаимодействие scFv 4П5-дибарназы с клетками 99 (конфокальная микроскопия)

3.3.4 Интернализация всЕу 4И5-дибарназы ЕШЗВ2-позитивными 100 опухолевыми клетками (электронная микроскопия)
3.4 Детекция человеческих опухолевых клеток с помощью юз иммуноРНКаз бсРу 4Б5-дибарназа, бсБу 405-барназа, бсРу 425-барназа и белка ЕСГФ-барстар
3.4.1 Конструирование слитого белка ЕСЕР-барстар и ЮЗ определение его функциональной активности
3.4.2 Детекция опухолевых клеток на основе взаимодействия 106 барназы и барстара методом проточной цитометрии
3.4.3 Детекция опухолевых клеток на основе взаимодействия 107 барназы и барстара методом флуоресцентной микроскопии
3.4.4 Возможность изучения интернализации иммуноРНКазы 113 всЕу 4Б5-дибарназа с помощью белка ЕСЕР-барстар
3.5 ЦИТОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ НА 115 ОПУХОЛЕВЫЕ И НОРМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ
3.5.1 Цитотоксическое действие барназы на человеческие 115 опухолевые клетки и нормальные мононуклеарные клетки периферической крови
3.5.2 Нацеливание барназы на опухолевые маркеры ЕШЗВ2 и П8 ЕСт с помощью специфических антител
3.5.3 Сравнительный анализ влияния барназы и всЕу 4Б5- 119 дибарназы на жизнеспособность клеток
3.5.4 Доказательства специфичности действия всЕу 405- 120 дибарназы на ЕШЗВ2-гиперэкспрессирующие клетки
3.5.4.1 Зависимость цитотоксического действия ясРу 405- 120 дибарназы от количества рецепторов ЕКВВ2 на поверхности человеческих клеток
3.5.4.2 Конкурентное ингибирование токсического действия 121 ясЕу 405-дибарназы мини-антителом ясЕу
3.5.4.3 Цитотоксичность ясЕу 405-дибарназы обусловлена 123 РНКазной активностью барназы
3.5.5 Зависимость токсического эффекта эсЕу 4Н5-дибарназы на 124 ЕБ£ВВ2-гиперэкспрессирующие клетки от времени воздействия
3.5.6 Цитотоксическое действие всЕу 425-барназы на 128 человеческие опухолевые клетки
3.6 Механизмы токсического действия барназы и 129 иммуноРНКазы бсРу 4Б5-дибарназа на раковые клетки
3.6.1 Деградация РНК в клетках, обработанных барназой или 8сЕу129 405-дибарназой
3.6.2 Морфологические изменения клеток под действием барназы 131 и бсЕу 405-дибарназы

3.6.3 Цитометрический анализ повреждения ДНК в клетках, обработанных барназой или scFv 4Б5-дибарназой
3.6.4 Анализ геномной ДНК клеток, обработанных барназой или scFv 405-днбарназой
3.6.5 Пикнозис ядер в клетках, обработанных scFv 4D5-дибарназой
3.6.6 Детекция фосфатидилсерина и активации каспазы-3 в клетках, обработанных барназой или scFv 4Б5-дибарназой
3.6.7 Схема взаимодействия барназы и иммунобарназных конъюгатов с опухолевой клеткой
3.7 Создание генетической конструкции для
ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ ТЕТРАЦИКЛИН-КОНТРОЛИРУЕМОЙ
ЭКСПРЕССИИ ИММУНОБАРНАЗНОГО КОНЪЮГАТА SCFV 4D5-
БАРНАЗА
3.7.1 Субклонирование гена иммуноРНКазы scFv 4В5-барназа в плазмиду для эукариотической экспрессии
3.7.2 Влияние тетрациклина на интенсивность флуоресценции клеток, котрансфицированных плазмидами, кодирующими гены белков scFv 4В5-барназа и EGFP
3.7.3 Оценка интенсивности флуоресценции белка EGFP в трансфицированных клетках НЕК293 методом проточной цитометрии
3.7.4 Очистка белка scFv 4Б5-барназа из трансфицированных клеток НЕК293 и культуральной среды
3.7.5 Жизнеспособность трансфицированных клеток НЕК293 определяли в тесте с трипановым синим
3.8 Определение системной токсичности белка scFv 4D5-
ДИБАРНАЗА НА МЫШАХ BDF1 И В ALB/C NUDE
3.8.1 Биохимический анализ крови мышей BDF1
3.8.2 Определение содержания форменных элементов крови у мышей
3.8.3 Гистологическое исследование действия иммуноРНКазы scFv 4В5-дибарназа на внутренние органы мышей
3.9 Определение противоопухолевой активности scFv 4D5-
ДИБАРНАЗЫ В МЫШАХ BALB/C NUDE
3.9.1 Определение уровня экспрессии ERBB2 в перевиваемых человеческих опухолях молочной железы
3.9.2 Противоопухолевый эффект scFv 405-дибарназы в мышах BALB/c nude, несущих человеческие опухоли молочной железы SKBR
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

и VH, разделенных глицин-сериновым линкером, продемонстрировали функциональную активность и высокую стабильность, следовательно, этот линкер совместим с обеими ориентациями доменов (VL-линкер-УН и VH-линкер-VL) [138, 139]. Однако пептидный линкер не стабилизирует фрагмент Fv и не предохраняет его от денатурации. Кроме того, внутри фрагмента или на границе с линкером может происходить частичный протеолиз белка. Некоторые фрагменты антител имеют тенденцию агрегировать. Тем не менее, стратегия создания scFv обеспечивает правильную стехиометрию (количественное соотношение между двумя доменами), и может быть реализована в одной генетической конструкции — экспрессионном векторе, кодирующем ген scFv антитела. scFv идеальны для нацеленной доставки к клеткам токсинов. Их размер не превышает 25 — 30 кДа, они быстро проникают из кровеносного русла к опухоли и распределяются в опухолевой массе, достигая максимального накопления через 0,5-6 ч после введения. Более того, при разработке рекомбинантных антител для клинического использования неизбежно встает вопрос о продукции этих белков в достаточных количествах. Предложены и разработаны различные экспрессионные системы, среди которых лидирующее место занимает экспрессия в излюбленном биохимическими лабораториями организме - Escherichia coli. Эта бактерия имеет ряд привлекательных для исследователей особенностей, манипуляции с ней достаточно просты и хорошо разработаны. Е. coli быстро растут и, следовательно, новые идеи, касающиеся изменений в структуре белка, могут быть быстро проверены экспериментально. Возможность масштабирования культуры является существенным преимуществом, так как это может обеспечить наличие достаточных для исследования количеств белка. Эффективность трансформации Е. coli не имеет себе равных среди других микроорганизмов, и это свойство делает Е. coli (наряду с ее фагами) пригодной, в частности, для конструирования и скрининга библиотек.
Функциональные полноразмерные антитела, по большей части, не могут быть продуцированы в Е. coli, потому что для их функционирования необходимо гликозилирование участков константной части (Fc). Отсутствие посттрансляционных модификаций в прокариотических клетках может отменять биологические функции антитела [140]. Таким образом, способность укороченных версий антител, в частности, фрагментов scFv, продуцироваться в Е. coli, помимо упомянутых выше их фармакокинетических достоинств, является неоспоримым преимуществом перед полноразмерными антителами. Одноцепочечные вариабельные фрагменты в значительной степени менее