Молекулярный анализ регуляторных элементов в геноме дрозофилы: энхансеров, инсуляторов и пограничных последовательностей форум-доменов

• Автор: Моисеева, Евгения Дмитриевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил.

Оглавление
Список сокращений
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы
Цели и задачи исследования
Научная новизна результатов исследования
Научно-практическая ценность
Апробация работы
Обзор литературы
Введение
Транскрипция у эукариот
Инициация транскрипции. Сборка преинициаторного комлекса
Регуляция инициации транскрипции
Разнообразие промоторных последовательностей эукариот
Базальные транскрипционные факторы, коактиваторы и регуляция транскрипции
Транскрипционные факторы
Элонгация транскрипции
Терминация транскрипции
Транскрипция и хроматин
Модификации гистонов
Изменение структуры хроматина при транскрипции
Дистантно действующие регуляторные элементы
Энхансеры и локусконтролирующие районы
Механизмы работы энхансеров
Инсуляторы
Инсуляторные белки
Механизмы работы инсуляторов, блокирующих энхансеры
Механизмы работы инсуляторов, обладающих барьерной функцией
Последовательности PRE/TRE и сайленсинг генов,
опосредованный белками группы Polycomb
Последовательности PRE/TRE и белки, взаимодействующие с ними
Состав и функции PRC
Состав и функции PRC
Механизмы клеточной памяти и сайленсинг, опосредованный белками группы Polycomb.
Заключение

Материалы и методы
Биологические материалы
Праймеры
Генетические конструкции, использованные в экспериментах по хроматин-
иммунопреципитации и для анализа доступности хроматина для ДНКазы I
Генетические конструкции, использованные в экспериментах по ко-трансфекции
Антитела
Выделение тотальной ДНК из взрослых мух Drosophila melanogasler
Получение компетентных клеток
Трансформация
Электроэлюция фрагмента ДНК из агарозного геля
Получение зонда методом cool-PCR
Гибридизация колоний со специфическим зондом
Выделение плазмидной ДНК
Стандартные молекулярно-биологические методы
Секвенировапие ДНК
Нормализация плазмидных конструкций по концентрации для трансфекции
Трансфекция культуральных клеток дрозофилы
Хроматин-иммунопрсципитация
Хроматин-иммунопреципитация плазмидных конструкций, трансфецированных в
культуральные клетки Schneider-
Анализ доступности хроматина для ДНКазы I
Щелочной Southern-блоттинг и гибридизация
Результаты
Исследование влияния энхансера мобильного элемента copia и инсулятора gypsy на структуру
хроматина генетических конструкций
Анализ связывания РНК-полимеразы 11, ТВР и уровня ацетилирования гистона НЗ в областях,
прилегающих к энхансеру, и в районе энхансера
Энхансер мобильного элемента copia вызывает появление открытой структуры хроматина, а
инсулятор gypsy приводит к «закрыванию» хроматина
Анализ доступности для ДНКазы I различных областей конструкций
Функциональный анализ пограничных областей форум-доменов
Фрагмент 70С содержит полярный сайленсер
Фрагмент 84D содержит неполярный сайленсер
Анализ хроматина областей 70С и 84D
Обсуждение
Роль энхансера мобильного элемента copia и инсулятора gypsy в изменении структуры хроматина
Роль пограничных областей форум-доменов в регуляции экспрессии генов

Выводы
Список литературы

являются консервативными и обнаружены и в позвоночных, где они также регулируют гомеотические гены (Schuettengruber et al, 2007). В настоящее время такие последовательности найдены и в геноме млекопитающих, так, например, PRE-Ar регулирует экспрессию гена MafB/Kreisler в геноме мыши, при этом данный регуляторный элемент является консервативным и способен к Ро1усотЬ-опосредованному сайленсингу в дрозофиле (Sing et al., 2009).
Области PRE были выявлены в геноме дрозофилы по их способности к Polycomb-опосредованному сайленсингу репортёрных генов в составе трансгенных конструкций, и большинство известных PRE не превышает нескольких сотен п.н. (Muller and Kassis, 2006). Хотя не существует простой консенсусной последовательности, которой было бы достаточно для обеспечения функционирования PRE, известен ряд белков, способных взаимодействовать с этими районами. Основным и наиболее важным с точки зрения функционирования PRE ДНК-связывающим белком является белок Pho (Pleiohomeotic), а также родственный ему белок Phol (Pho-like) (рис. 9а) (Brown et al., 1998; Brown et al., 2003), которые взаимодействует с областями PRE, вытесняя нуклеосомы (Mohd-Sarip et al, 2006). Мухи, несущие мутацию в гене белка Pho, обладают дефектами, характерными для нарушений в сайленсинге гомеотических генов, что свидетельствует о необходимости данного белка для функциональной активности эндогенных областей PRE. Данный белок способен рекрутировать к областям PRE PRC1 и PRC2, что бьшо подтверждено с помощью хроматин-иммунопреципитации (Wang et al., 2004). Аналогичные результаты были получены при внесении мутаций в сайты связывания Pho, что привело к прекращению сайленсинга репортёрного гена и исчезновению PRC1 в области PRE в составе трансгенной конструкции (Klymenko et al., 2006). Вместе с белком dSfmbt, специфически связывающимся с H3K9mel, H3K9me2, H4K20mel и H4K20me2, Pho образует гетеродимер, который представляет собой ещё один тип комплексов белков группы Polycomb - Pho-RC (Pho repressive complex) (Klymenko et al, 2006).
Кроме Pho с ДНК областей PRE/TRE взаимодействуют и другие белки, которые также могут рекрутировать компоненты комплексов белков группы Polycomb путём белок-белковьтх взаимодействий. Например, GAGA-фактор (Strutt et al., 1997), Pipsqueak (Huang et al., 2002), Graynyhead (Blastya'k et al., 2006), Dspl (Dejardin et al., 2005), белки семейства SP1/KLF (Brown et al„ 2005).
Попытка предсказания областей PRE/TRE по нуклеотидной последовательности с учётом наличия сайтов связывания известных, взаимодействующих с ДНК PRE/TRE белков, выявила 167 возможных PRE/TRE последовательностей по всему геному дрозофилы, функциональность трёх из которых была подтверждена экспериментально