Анализ структуры и получение в прокариотической системе рекомбинантного белка G2 хантавируса серотипа пуумала, изолированного из зоонозного очага на территории Республики Башкортостан

• Автор: Мухаметханов, Наиль Ханафиевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 125 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Общие сведения о геморрагической лихорадке с почечным синдромом

1.2 Молекулярная биология, филогения и зоогеография хантавирусов

1.2.1 Зоогеография хантавирусов

1.2.2 Особенности организации генома хантавирусов

1.2.3 Синтез вирусной РНК и созревание вирионов

1.2.4 Функции вирусных белков

1.3 Вакцины
1.3.1. Генно-инженерные вакцины
1.3.2 ДНК-вакцины. Особенности генетической иммунизации
1.3.3 Преимущества ДНК-вакцин и возможные ограничения в их применении
1.3.4 Вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом

Глава 2 Объект и методы исследований
2.1 Краткая характеристика объектов исследований
2.2 Выделение и очистка тотальной РНК из образцов легочной ткани 54 рыжей полсти.(СІеіИгіопот} glareolus)
2.3 Выделение и очистка суммарной РНК из образцов крови 55 больных, заболевших ГЛПС.
2.4 Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.5 Выделение плазмидной ДНК методом мягкого лизиса
2.6 Удаление РНК из препаратов плазмидной ДНК
2.7 Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами
2.8 Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих 60 условиях
2.9 Препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих 62 условиях
2.10 Синтез кДЖ
2.11 Полимеразная цепная реакция
2.12 Элюция ДНК из агарозных гелей
2.13 Концентрирование ДНК бутанолом
2.14 Приготовление компетентных клеток
2.15 Приготовление вектора для клонирования
2.16 Секвенирование ДНК

2.17 Лигирование вектора и фрагмента ДНК

2.18 Трансформация компетентных клеток Е.соИ плазмидной ДНК
2.19 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2.20 Индукция 1ас промотора
2.21 Электрофорез полипептидов Е
2.22 Твердофазный иммуноферментный анализ
2.23 Реактивы и материалы
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

взаимодействия с РНК. Из трех видов вирусной гРНК, кРНК, мРНК - мРНК не инкапсидируется.
Сигналом для инкапсидации геномной РНК N белком является петлеобразная структура на 5'конце, в образовании которой учавствуют с 1 по 39 нуклеотид (Flint et al., 2000). Возможно, что инкапсидирование носит кооперативный характер. РНК связывающий домен нуклеокапсидного белка охватывает среднюю часть, включающую аминокислотные остатки, начиная с 175 по 217 аминокислоты для серотипа HTNV (Xu et al., 2002). Идентичность и сходство этого района вируса HTNV с другими серотипами PUU, TOPV, SNV, PHV составляет от 58% до 86%.
Другой функцией нуклеокапсидного белка является его участие в репликации вирусной РНК совместно с транскриптазой. Это было подтверждено рядом исследователей, использовавших технологию обратной генетики (Dunn et al. 1995; Bridgen, Elliott, 1996; Flick et al., 2003). Кроме того, оба белка локализованы в районе комплекса Гольджи (Kukkonen et al., 2004). N белок ингибирует трансляцию клеточной РНК, образует комплекс с кэп-частицей, вытесняя факторы инициации трансляции elF4F-elF4E. Связывается с прединициацонной частицей 43S рибосомой и вытесняет фактор elF4G. Фактор elF4G осуществляет взаимодействие между elF4F-elF4E и РАВР-белком (поли-А связывающийся белок). N белок заменяет функцию фактора elF4A (Mir, Panganiban, 2008), обладая хеликазной активностью, необходимой для инициации трансляции. В конечном итоге L белок отщепляет кэп-частицу с мРНК клетки, а N белок заменяет эукариотические факторы инициации трансляции для трансляции вирусных белков. Эти исследования подтверждают кооперативное действие L и N белка в синтезе РНК.
Взаимодействие N белка с цитоплазматическим доменом гликопротеина G1 через мотив YRTL способствует сборке вирусов. Мотив YRTL (YxxL) является высоко-консервативным среди G1 белков хантавирусов и служит сигналом сборки вирусов. Взаимодействует ли N