Молекулярный механизм цинк-зависимой димеризации бета-амилоида при болезни Альцгеймера

• Автор: Куликова, Александра Александровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Протеинопатии
1.1.1. Протеинопатии
1.1.2. Неправильный фолдинг белков и агрегация
1.1.3. Амилоидные фибриллы
1.1.4. Защитные внутриклеточные механизмы, активируемые при протеинопатиях
1.2. Болезнь Альцгеймера
1.2.1. Болезнь Альцгеймера
1.2.2. р-амилоид, протеолитический процессинг белка АРР, мутации, ассоциированные с болезнью Альцгеймера
1.2.3. Агрегация р-амилоида, образование нейротоксических агентов
1.3. Роль ионов цинка в развитии болезни Альцгеймера
1.4. Металлсвязывающий домен АР
1.4.1. Роль мутаций и посттрансляционных модификаций металлсвязывающего домена Ар
в патогенезе болезни Альцгеймера
1.4.1.1. Мутации металлсвязывающего домена Ар
1.4.1.2. Посггрансляционные модификации металлсвязывающего домена Ар
1.4.1.3. Металлсвязывающий домен АР крыс и мышей
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты и материалы
2.1.1. Использованные реактивы
2.1.2. АР, его фрагменты и модифицированные формы
2.1.3. Клеточная культура
2.2. Методы исследований
2.2.1. Определение концентраций
2.2.2. Изотермическая калориметрия титрования
2.2.2. Оптический биосенсор, работающий на эффекте поверхностного плазмонного резонанса
2.2.3. Масс-спектрометрия с ионизацией распылением в электрическом поле
2.2.4. Гибридный квантово-механический/молекулярно-механический метод
2.2.5. Спектроскопия ЯМР
2.2.6. Проточная цитофлуорометрия
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Определение минимального цинк-связывающего сайта в металлсвязывающем домене АР человека
3.2. Определение сайта димеризации металлсвязывающего домена АР
3.3. Влияние модификаций в металлсвязывающем домене Ар на его взаимодействие с ионами цинка
3.3.1 Механизм цинк-зависимой димеризации металлсвязывающего домена АР крысы.
3.3.2. Влияние фосфорилирования остатка серина в положении восемь металлсвязывающего домена Ар человека на его взаимодействие с ионами цинка.
3.3.3. Влияние мутации остатка гистидина в положении шесть металлсвязывающего домена Ар человека на его взаимодействие с ионами цинка
3.3.4. Влияние изомеризации остатка аспарагиновой кислоты в положении семь Ар человека на его нейротоксические свойства
3.4. Молекулярный механизм цинк-зависимой димеризации металлсвязывающего домена Ар человека и его патогенных модификаций
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
ПРИЛОЖЕНИЕ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследования. Изменение структуры белков, приводящее к их патологической агрегации, лежит в основе развития ряда нейродегснеративных заболеваний -протеинопатий. Особое место среди протеинопатий занимает болезнь Альцгеймера (БА) -наиболее распространенная причина деменции пожилых людей. БА диагностируется примерно у 11% лиц старше 65 лет и у 32% - старше 85 лет. Увеличение продолжительности жизни в ближайшем будущем делает БА одной из основных проблем, с которой столкнутся системы здравоохранения развитых стран. В 2010 г. во всем мире насчитывалось 36 млн. человек с диагнозом БА, а к 2050 г. их число может составить 115 млн.
Степень разработанности темы исследования. БА характеризуется наличием амилоидных бляшек в межклеточном пространстве и внутриклеточных нейрофнбриллярных клубков в головном мозге пациентов. Основным компонентом амилоидных бляшек является бета-амилонд (АР) - пептид, состоящий из 36-43 аминокислотных остатков. Согласно «амилоидной гипотезе» возникновения БА [1], ключевым событием, запускающим патогенный каскад заболевания, является процесс агрегации Ар в нейротоксичные димеры и олигомеры, а затем -в амилоидные бляшки. На сегодняшний день детальный молекулярный механизм агрегации Ар остается неизвестным. Важную роль в этом процессе играют ионы цинка. Первые шестнадцать аминокислотных остатков Ар формируют его металлсвязывающий домен — АР(1-16). Наличие мутаций и постгрансляционных модификаций в Ар(1-16) оказывает влияние на процесс агрегации Ар и, таким образом, на развитие БА.
В настоящее время не существует эффективных лекарственных средств, способных остановить течение заболевания. В связи с этим ведется активный поиск новых лекарственных мишеней. Выявление молекулярных основ патогенной агрегации Ар, а именно, взаимодействия металлсвязывающего домена Ар(1-16) и его природных изоформ с ионами цинка, представляет большой интерес в свете направленного поиска терапевтических мишеней и борьбы с БА.
Цели н задачи. Целью настоящей работы являлось определение молекулярного механизма цинк-зависимой димеризации металлсвязывающего домена АР(1-16) и его модификаций при БА.
В задачи работы входило:
1. Установление аминокислотных остатков, хелатирующих 7п2’, в мономерном комплексе АР(1-16) человека с цинком.
2. Определение сайта цинк-зависимой димеризации АР(1-16) человека.
3. Исследование влияния трех замен в АР(1-16) крысы на его взаимодействие с ионами цинка.

выражается в изменении значения (сдвиге) резонансного угла (рисунок 12Б,В). Изменение значения резонансного угла выражается в относительных резонансных единицах (РЕ). 1000 РЕ соответствует изменению угла на 0,1°. Результаты БППР представляются в виде сенсограммы, которая отражает изменения сигнала, выраженного в РЕ, как функции времени. Величина сигнала прямо пропорциональна количеству лиганда, связавшегося на поверхности чипа.
Работа с использованием БППР была выполнена совместно с сотрудниками Лаборатории межмолекулярных взаимодействий Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» Ивановым А.С. и Мезенцевым Ю.В. на биосенсоре BIAcore 3000 (GE Healthcare Life Sciences, США). Ориентированная иммобилизация на оптическом чипе СМ5 по SI-1-группе пептида A(3(l-16)-G4-C (рисунок 12А) была проведена согласно протоколу производителя (Sensor surface handbook, GE Healthcare Life Sciences, США) в IIBS буфере при скорости потока 5-мкл/мин. Иммобилизация включала четыре этапа: (1) активацию карбоксилированного декстрана смесыо 100 мМ NIIS и 400 мМ EDC (30 мкл) в течение 2 мин; (2) вторичную активацию 80 мМ раствором PDEA в 0,1 М боратном буфере (pH 8,5) в течение 4 мин;
(3) инжекцию раствора 0,05 мг/мл Ap(l-16)-G4-C в ацетатном буфере (pH 4,5) в течение 7 мин;
(4) инактивацию пепрореагировавших групп раствором, содержащим 50 мМ цистеина, 1 М NaCl, 0,1 М ацетат натрия (pH 4,0) в течение 4 мин. Уровень сигнала биосенсора после иммобилизации Ap(l-16)-G.rC увеличился на 719 РЕ, что соответствует 719 пг иммобилизованного пептида.
Эксперименты проводились в 10 мМ HEPES буфере (pH 6,8) в отсутствии либо в присутствии 100 мкМ ионов цинка или меди, при скорости потока 5 мкл/мин, температуре 25°С как описано в [216]. Над чипом с иммобилизованным Ap(l-16)-G4-C пропускались растворы 25 мкл пептидов Ар(1-16), АР(6-14), АР(11-14), АР(7-14), АР(6-13), АР(1-5) в разных концентрациях (таблица 3) в течение 300 с. В качестве контроля использовался канал с карбоксиметилированным декстраном, свободным от иммобилизованного белка.
Константы скоростей ассоциации (коп) и диссоциации (код) были получены при обработке сенсограмм с помощью программы BIAevaluation 4.1 с использованием модели Лангмюра (связывание 1:1). Из этих данных были рассчитаны равновесные константы ассоциации Ка и диссоциации Kj, используя соотношение: Ka=(Kj)~ =k0Jk0jf.
По аналогичной методике был проведен анализ взаимодействия иммобилизованных pAP(l-16)-G4-C и Ap(l-16)H6R-G4-C с 15 мкМ рАр(1-16) и 15 мкМ AP(1-16)H6R, соответственно, в присутствии и отсутствии 100 мкМ ZnCl2.