Обнаружение новой 5mC-зависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы BisI и установление её субстратной специфичности

• Автор: Землянская, Елена Васильевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 92 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений
1. ВВЕДЕНИЕ
2. СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ И СВОЙСТВА МЕТИЛЗАВИСИМЫХ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ДНК-ЭНДОНУКЛЕАЗ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
2.1. РАЗНООБРАЗИЕ И РАСПРОСТРАНЕНИЕ МД-ЭНДОНУКЛЕАЗ
2.2. СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ МД-ЭНДОНУКЛЕАЗ
2.2.1. Классификация по характеру сайта узнавания и позиции расщепления ДНК
2.2.2. Типы узнаваемых модификаций ДНК
2.2.3. Узнаваемая последовательность нуклеотидов
2.2.4. «Рисунок» метилирования ДНК-субстрата
2.3. СВОЙСТВА МД-ЭНДОНУКЛЕАЗ
2.3.1. Зависимость активности от ионов двухвалентных металлов
2.3.2. Зависимость активности от НТФ
2.3.3. Зависимость активности от количества сайтов узнавания
2.3.4. Эндонуклеазная активность in vitro
2.4. РОЛЬ МД-ЭНДОНУКЛЕАЗ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ
2.5. ПРИМЕНЕНИЕ МД-ЭНДОНУКЛЕАЗ
2.5.1. МД-эндонуклеазы в эпигенетических исследованиях
2.5.2. МД-эндонуклеазы в биотехнологии и молекулярно-биологических исследованиях
2.5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. МАТЕРИАЛЫ
3.2. МЕТОДЫ
3.2.1. Выращивание штаммов микроорганизмов
3.2.2. Выделение ДНК и генно-инженерные манипуляции

3.2.3. Конструирование геномной библиотеки и селекция клопов, содержащих ген ДНК-метштрансферазы M.Fsp4HI
3.2.4. Выделение ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI
3.2.5. Определение метилируемого основания в сайте узнавания ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4Hl
3.2.6. Обнаружение и определение таксономической принадлежности штамма Bacillus subtilis ТЗО
3.2.7. Количественное определение содержания сайт-специфической эндонуклеазной активности в биомассе В. subtilis ТЗО
3.2.8. Подготовка к работе аффинного сорбента CPG-2000 Oligo
3.2.9. Выделение сайт-специфической эндонуклеазы Bis1
3.2.10. Определение оптимальных условий метилирования и гидролиза ДНК
3.2.11. Расщепление ДНК плазмид и фагов эндонуклеазами Bisl и Fsp4HI
3.2.12. Введение радиоактивной фосфорной метки
3.2.13. Гидролиз олигонуклеотидных ДНК-дуплексов сайт-специфическими эндонуклеазами и экзонуклеазой III из E.coli
3.2.14. Определение оптимального варианта метилирования сайта узнавания эндонуклеазы Bisl
3.2.15. Расщепление ДНК плазмиды pUC19 с присоединенными метилированными олигонуклеотидами эндонуклеазой Bisl
3.2.16. Другие методы
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДЫ, НЕСУЩЕЙ ГЕН ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ M.FSP4HI
4.1.1. Клонирование гена ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI
4.1.2. Выявление открытых рамок трансляции и их анализ
4.1.3. Выделение рекомбинантной ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI и определение метилируемого основания в сайте узнавания

4.2. ОБНАРУЖЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА НОВОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ, СПЕЦИФИЧЕСКИ РАСЩЕПЛЯЮЩЕЙ ДНК ПЛАЗМИДЫ PFSP4HI1
4.3. ВЫДЕЛЕНР1Е НОВОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ BIST
4.3.1. Выращивание штамма В. subtilis ТЗО и определение активности Bisl в биомассе
4.3.2. Хроматографическая очистка эндонуклеазы Bisl
4.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ ГИДРОЛИЗА ДНК ЭНДОНУКЛЕАЗОЙ BISI
4.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ B1SI
4.5.1. Определение нуклеотидной последовательности, узнаваемой эндонуклеазой Bisl
4.5.2. Исследование чувствительности МД-эндонуклеазы Bisl к 4тС-метилированию сайта узнавания
4.5.3. Определение места гидролиза ДНК МД-эндонуклеазой Bisl
4.5.4. Установление способности МД-эндонуклеазы Bisl расщеплять сайт узнавания с различным количеством и расположением С5-метилцитозиновых оснований
4.5.5. Определение канонического варианта метилирования сайта узнавания МД-эндонуклеазы Bisl
4.6. ВОЗМОЖНОСТИ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МД-ЭНДОНУКЛЕАЗЫ B1S1 В МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

3.2.3. Конструирование геномной библиотеки и селекция клонов, содержащих ген ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI
Геномную ДНК из штамма F. species 4Н гидролизовали ЭР EcoRI (сайт узнавания 5’-GJ,AATTC-3’), фрагменты лигировали с плазмидой pUC19, линеаризованной той же эндонуклнеазой рестрикции и обработанной щелочной фосфатазой из кишечника теленка для предотвращения
лигирования концов вектора самих на себя. Компетентные клетки E. coli ER 2267 после электропорации продуктами лигазной сшивки высевали на чашки с селективной средой. Из выросших колоний выделяли суммарную
плазмидную ДНК. Полученную клонотеку обрабатывали эндонуклеазой рестрикции Fsp4HI. Продуктами гидролиза плазмидной ДНК вновь трансформировали компетентные клетки E. coli ER 2267. Из выросших на среде с ампициллином клонов выделяли плазмидную ДНК и проверяли ее устойчивость к расщеплению эндонуклеазой рестрикции Fsp4HI.
Тестирование эндонуклеазной активности в грубых лизатах клонов проводили согласно ранее описанной методике [Белавин и др., 1988].
3.2.4. Выделение ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI
ДНК-метилтрансферазу M.Fsp4FU выделяли из клеток E. coli, несущих рекомбинантную плазмиду pFsp4FII2 с геном fsp4HIM. Все процедуры выделения фермента проводили при температуре 4°С.
13 г сырой биомассы E. coli суспендировали в 20 мл буфера “М”, содержащего 0,3 мг/мл лизоцима. Клетки обрабатывали ультразвуком на дезинтеграторе Soniprep 150 (“MSE”, Англия) 5 раз по 30 с с интервалами по 1 мин для охлаждения суспензии. В процессе озвучивания добавляли тритон Х-100 до 0,1%. Лизат осветляли центрифугированием в течение 30 мин при 15000 об/мин на центрифуге J2-21 (“Beckman”, США). Препарат фермента получали путем хроматографической очистки в пять стадий на следующих сорбентах: 25 мл фосфоцеллюлозы Р-11, 7 мл гепарин-сефарозы, 4 мл гидроксиапатита, 30 мл сефакрила S-200, 4 мл фосфоцеллюлозы Р-11.