Экспрессия и характеристика новых изоформ лиганда Wnt11

• Автор: Посвятенко, Александра Викторовна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

Список использованных сокращений
1. Общая характеристика работы
1.1 Введение
2. Обзор литературы
Современные представления о механизмах регуляции сигнальных путей Wnt и их
роль в канцерогенезе
2.1 Белки Wnt
2.2 Сигнальный путь Wnt
Канонический ß-катенин-зависимый сигнальный путь
Неканонический, кальций-зависимый сигнальный путь Wnt
Неканонический сигнальный путь Wnt. Путь планарной клеточной полярности
2.3 Многообразие сигнальных путей Wnt и факторы, определяющие тип активируемого сигнального каскада
Классификация лигандов Wnt и рецепторов Fzd
Роль корецептора LRP5/6 в определении типа активируемого сигнального пути
Контроль активации сигнальных путей Wnt с участием регуляторных молекул
Активация сигнальных путей Wnt может происходить с участием
альтернативных рецепторов
Альтернативные рецепторы или корецепторы?
Механизмы активации сигнального пути Wnt с участием белков, не принадлежащих к семейству Wnt
2.4 Роль сигнальных путей Wnt в канцерогенезе
Канонический сигнальный путь и его роль в канцерогенезе
Роль неканонических сигнальных путей Wnt в формировании и прогрессии опухолей
3. Материалы и методы исследований
Ферменты и реактивы
Выделение РНК, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
Гель-электрофорез ДНК
Секвенирование
Молекулярное клонирование
Создание экспрессионных конструкций, кодирующих микроРГІК
Трансформация клеток E
Культивирование клеточных линий, трансфекция
Получение антител к белку hWntl
Электрофорез в денатурирующих условиях в ДСН-ПААГ и Вестерн-блот анализ

Двойной люцифсразный тест
Аффинная хроматография
Аффинная хроматография с сефарозой, несущей антитела к БЕО-эпитопу
Статистическая обработка результатов
Программное обеспечение
4. Результаты и обсуждение
4.1 Исследование экспрессии лиганда ЫЛйэП 1 в различных опухолевых и нормальных клетках
Экспрессия лиганда наблюдается в различных клеточных линиях меланомы
человека
Экспрессия лиганда к Wnt.ll в клетках линий колоректально рака
Экспрессия лиганда hWntll в клетках нормальных тканей человека
4.2 Экспрессия лиганда К¥п1;1 1 сопровождается альтернативным сплайсингом
4.3 Исследование свойств белковых продуктов сплайс-вариантов 1т\гпШ8р1 и йУпИ 1 эрЗ
Создание экспрессионных конструкций и получение специфических антител против
hWntll
Белковый продукт альтернативного сплайсинга 1Б¥ш11зрЗ связывается с
гепарин-сефарозой, но не секретируется
В клетках линии НТ29 антителами против ИШпШ выявлен набор
иммунореактивных полос различной молекулярной массы
Белковый продукт альтернативного сплайсинга 1гШп111зр1 связывается с
гепарин-сефарозой и сохраняет способность секретироватъся
Белковый продукт сплайс-варианта hWntllspl связывается с регуляторным белколл WIF
4.4 Исследование функциональной активности изоформ лиганда йЛУпП
Экспрессия лиганда 1№м11 ингибирует активацию канонического сигнального
пути Wnt
Экспрессия эндогенного кЖш! 1 может влиять на активацию канонического
сигнального пути Шм
Исследование функциональной активности сплайс-вариантов лиганда /гИ'л/77
5. Заключение
6. Выводы
Список литературы
Благодарности
Список использованных сокращений
АРС Adenomatous Polyposis Coli (аденоматозный полипоз толстой кишки)
ЬТгСР beta-Transducin repeat Containing Protein (белок, содержащий р-
трансдуциновый повтор)
САМКИ Ca2+/Calmodulin-dependent protein Kinase II (Са27кальмодулин-зависимая
киназа II)
CKI Casein Kinase 1 (казеин киназа 1)
CRD Cysteine-Rich Domain (домен богатый нистеиновыми аминокислотными
остатками)
Cthrcl Collagen triple helix repeat containing 1 (белок, содержащий коллаген
подобный повтор)
Daaml Dishevelled associated activator of morphogenesis 1 (активатор морфогенеза,
ассоциированный с Dishevelled)
Dkk Dickkopf
Dsh Dishevelled
EOF Epidermal Growth Factor (эпидермальный фактор роста)
Fmi Flamingo
Fzd Frizzled
GAPDH Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase
(глицсральдегидЗ-фосфатдегидрогеназа)
GSK-3p Glycogen Synthase Kinase-3 (киназа-3 гликогенсинтазы)
JNK c-Jun N-terminal Kinase (c-Jun N-терминальная киназа)
LRP Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein (белок родственный
рецепторам липопротеинов низкой плотности)
ММР Matrix Metal loproteinase (матриксная металлопротеиназа)
РСР Planar Cell Polarity (планарная клеточная полярность)
Pk Prikle
РКС Protein Kinase С (протеинкиназа С)
PVDF Polyvinylidene diFluoride (поливинилиденфторид)
ROCK Rlio-associated protein Kinase (Rho-ассоциированная протеинкиназа)
Ror Receptor tyrosine-kinase like Orphan Receptor (рецептор семейства
тирозиикиназ, подобный рецепторам - сиротам)
Ryk Related to Receptor tyrosine (Y) kinase (родственный тирозинкиназным
рецепторам)
SFRP Secreted frizzled-related protein (секретируемые белки родственные Frizzled)
Stbm Strabismus

3. Материалы и методы исследований Ферменты и реактивы
В работе использовались ферменты, производимые фирмой «Fermentas» (Литва), и реактивы производства фирм «Sigma-Aldrich» (США), «Merck» (Германия), «ICN» (США), «Bio-Rad» (США), «GE Healthcare» (США), «Applichem» (Германия), «Helicon» (Россия), «МР Biomedicals» (США), BD (США). Олигонуклеотиды для проведения ОТ-ПЦР, ПЦР и создания конструкций, кодирующих премикроРНК были заказаны в фирме «Литех» (Россия).
Выделение РНК, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
РНК выделяли из клеток линий меланомы человека и колоректального рака, а также из тканей человека по стандартному протоколу с модификациями [159]. Стволовые эмбриональные клетки были любезно предоставлены Ревазовой Е.С. (International Stem Cell Corporation, США), образцы других тканей были получены при хирургических вмешательствах, обусловленных медицинскими показаниями. Клетки или образцы тканей лизировали в буфере (4М гуанидин изотиоционат; 25мМ цитрат натрия, рН=7.0; 0.5% лауросаркозил натрия; 0.1 М (3-меркаптоэтанол), далее добавляли 0.1 объема 2М ацетата натрия, рН=4.0. Далее проводили экстракцию с помощью кислого фенола, с последующей экстракцией супернатанта хлороформом с изоамиловым спиртом (24:1). Затем осаждали РНК из супернатанта одним объёмом пропанола при -20° в течение часа. После осаждения РНК центрифугированием в течение 20 минут 3000 об/мин при +4°С. Осадок растворяли в лизирующем буфере (без добавления меркаптоэтанола, объем 1/3 от первоначального объема лизата) и повторяли осаждение, добавляя равный объем изопропанола. Осадок промывали 70% этанолом и растворяли в чистой воде. Концентрацию и чистоту РНК оценивали спектрофотомстрическим методом.
Полученная тотальная РНК далее использовалась для получения первой цепи
кДНК в реакции обратной транскрипции под действием ревертазы RevertAid Reverse
Transcriptase ("Fermentas", Литва). Реакция обратной транскрипции проводилась в
условиях, рекомендованных производителем ревертазы. Для каждой реакции
использовалось по 1 мкг тотальной РНК. Первая цепь кДНК далее была использована в
качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для осуществления ПЦР
использовались пластиковые пробирки 0.65 мл («Coming Incorporated», США) и
ПЦР-прибор Omnigene («HYBAID», Великобритания). ПЦР-смесь включала в себя воду
«HyPure™ Molecular Grade Water Nuclease-Free, Deionized, Distilled, 0.1 um Sterile Filtered»
(«HyClone», США) и реагенты производства «Fermentas» (Литва): набор dNTP, Taq