Тест-система на основе мутантных форм цитохрома c для количественного определения супероксидного анион-радикала

• Автор: Пепелина, Татьяна Юрьевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Цитохром с как переносчик электронов и антиоксидант
1.1. Дыхательная цепь митохондрий
1.1.1. Организация дыхательной цепи митохондрий
1.1.2. Мультисубъединичные дыхательные комплексы
1.1.2.1. Комплекс I (МАОН: убихинон - оксидоредуктаза)
1.1.2.2. Комплекс III (убихинол: цитохром с - оксидоредуктаза)
1.1.2.3. Комплекс IV (цитохром с - оксидаза)
1.2. Цитохром с
1.2.1. Структура и функции цитохрома с
1.2.1.1. Структура цитохрома с
1.2.1.2. Функции цитохрома с
1.2.2. Взаимодействие цитохрома с с белками-паргнерами
1.2.2.1. Взаимодействие цитохрома с с убихинол: цитохром с-
оксидоредуктазой
1.2.2.2. Взаимодействие цитохрома с с цитохром с - оксидазой
1.2.2.3. Взаимодействие цитохрома с с цитохромом
1.2.2.4. Взаимодействие цитохрома с с фактором АраЩ
1.2.2.5. Взаимодействие цитохрома с с цитохром с - пероксидазой
1.3. Супероксидный анион-радикал
1.3.1. Образование супероксидного анион-радикала
1.3.2. Методы регистрации супероксидного анион-радикала

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Реактивы и наборы реактивов
2.1.2. Ферментные препараты
2.1.3. Штаммы Escherichia coli
2.1.4. Плазмидный вектор
2.1.5. Олигонуклеотидные праймеры
2.1.6. Буферные растворы
2.1.7. Питательные среды
2.2. Методы исследования
2.2.1. Трансформация клеток Escherichia coli
2.2.1.1. Приготовление компетентных клеток E.coli
2.2.1.2. Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК
2.2.1.3. Наработка клеточной биомассы для выделения плазмидной ДНК
2.2.1.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.2.2. Сайт-направленный мутагенез
2.2.3. Субклонирование мутантных генов
2.2.4. Рестрикционный анализ
2.2.5. Секвеиирование ДНК
2.2.6. Биосинтез и выделение белка
2.2.6.1. Экспрессия генов рекомбинантных белков
2.2.6.2. Выделение и очистка рекомбинантных белков
2.2.6.3. Окисление и восстановление мутантных вариантов цитохрома с
2.2.1. Функциональные исследования
2.2.7.1. Измерение окислительно-восстановительного потенциала
2.2.1.2. Выделение митохондрий печени крысы

2.2.13. Получение препарата митопластов, лишенных цитохрома с, из митохондрий печени крысы
2.2.7.4. Получение препарата митохондрий из сердца быка
2.2.7.5. Получение препарата СМЧ из митохондрий сердца быка
2.2.1.в. Сопряжение и активация СМЧ
2.2.1.1. Определение сукцинат: цитохром с - редуктазной активности митопластов спектрофотометрическим методом
2.2.13. Определение цитохром с - оксидазной активности митопластов полярографическим методом
2.2.7.9. Расчет кинетических параметров реакций
2.2.7.10. Измерение генерации супероксида в СМЧ сердца быка в реакции прямого и обратного переноса электронов
2.2.7.11. Измерение скорости образования перекиси водорода в СМЧ сердца быка в реакции прямого и обратного переноса электронов
2.2.8. Аналитические методы
2.2.8.1. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле
2.2.8.2. Количественное определение препаратов ДНК
2.2.8.3. Электрофоретический анализ белков в ББЗ-ПААГ
2.2.8.4. Количественный анализ белковых препаратов
2.2.8.5. Определение концентрации белка биуретовым реактивом
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Исследование роли индивидуальных лизиновых остатков цитохрома с лошади в формировании реакционноспособных комплексов с компонентами дыхательной
цепи
3.1.1. Получение мутантных вариантов цитохрома с, содержащих единичные и двойные замены

NADH —> цитохром b$ редуктаза —> цитохром Ь$ —» цитохром с —> цитохром с -оксидаза —* Ог [1].
При этом происходит перенос электронов по дыхательной цепи в обход начальных ее участков (участков генерации АФК).
Апоптотическая активность
Известно участие цитохрома с в апоптозе [6, 73]. Нужно отметить, что апоптозная активность характерна для цитохромов с позвоночных, но полностью отсутствует в цитохроме с дрожжей [74]. Остаток Lys72 в дрожжевом цитохроме с триметилирован, и это, предположительно, является причиной отсутствия у последнего апоптозной активности.
Для запуска апоптоза цитохрому с необходимо покинуть пределы митохондрии и попасть в цитозоль. При запуске апоптоза существует эффект положительной обратной связи: цитохром с активирует каспазы, которые, в свою очередь, приводят к выходу новой порции цитохрома с [75]. Выброс цитохрома с из митохондрий ингибируется белком Вс1-2 [75 - 77]. При этом он способен замедлять прохождение апоптоза даже тогда, когда цитохром с уже оказался в цитозоле [75]. Необходимо отметить, что цитохром с вызывает апоптоз вне зависимости от того, как он попал в цитозоль: высвободился из митохондрий или был введен экзогенно [77].
Высвобождаемый из митохондрий цитохром с вместе с цитоплазматическим фактором APAF-1 (apoptosis protease activating factor-1) участвует в активации каспазы-9 [78]. APAF-1 - белок с молекулярной массой 130 кДа, содержащий CARD-домен (caspase activation and recruitment domain) в Л'-концевой последовательности и 13 повторяющихся аминокислотных WD-40-последовательностей (WD - дипептид, состоящий из остатков триптофана и аспартата) в С-концевой последовательности [79], образует комплекс с прокаспазой-9 в присутствии цитохрома с и dATP или АТР [78]. Из этих субъединиц собираются жесткие, симметричные структуры, наподобие веера или пропеллера [80].