Исследование метаболизма цистеина у Escherichia coli

• Автор: Зиятдинов, Михаил Харисович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 93 с. : ил.

Оглавление

Список используемых сокращений

1. Введение

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цели и задачи работы

1.3. Научная новизна и практическая ценность работы

1.4. Список работ, опубликованных по теме диссертации

2. Обзор литературы

2.1. Происхождение углеродного скелета цистеина

2.2. Транспорт сульфата в клетку

2.3. Восстановление серы от степени окисления +6 до -
2.4. Энергетические затраты на синтез углеродного скелета цистеина
2.5. Токсичность цистеина
2.6. Цистеин в качестве антиоксиданта
2.7. Регуляция биосинтеза цистеина
2.7.1. Регуляция экспрессия Суэ-регулона
2.7.2. Регуляция потока углерода от 3-фосфоглицерата до цистеина.,
2.8. Ферменты, катализирующие превращение серина в цистеин
3. Материалы и методы исследования
3.1. Бактериальные штаммы и среды
3.2. Конструирование штаммов
3.3. Определение активности глутатионредуктазы
3.4. Определение активности Б-сульфоцистеин редуктазы
3.5. Определение активности Ь-серин-О-ацетилтрансферазы
3.6. Компьютерное моделирование каталитического сайта Ь-серин-О-ацетилтрансферазы
3.7. Получение мутаций в гене суэЕ методом рандомизации
4. Результаты исследований и обсуждение

4.1. Получение и изучение мутантных вариантов серинацетилтрансферазы (САТ), устойчивых
к ингибированию цистеином
4.2. Изучение процессов транспорта предшественника цистеина, О-ацетилсерина
4.3. Изучение восстановления Б-сульфоцистеина до цистеина
клетками кишечной палочки
4.4. Изучение функции продукта гена уфК
5. Выводы
6. Список литературы
Список используемых сокращений
ФГД - 3-фосфоглицератдегидрогеназа;
CAT - серинацетилтрансфераза
ОАСС - О-ацетилсеринсульфгидрилаза, или цистеинсинтаза ОАС - О-ацетилсерин NAC, NAS - N-ацетилсерин РЕР - фосфоенолпируват
АТФ, АДФ, АМФ - аденозинтри-..., аденозинди-..., аденозинмонофосфат Acetyl-CoA, СоА (CoASH) - ацетилкофермента А, кофермент А NADH, NAD+ - восстановленная и окисленная форма никодинамиддинуклеотида
NADPH, NADP+ - восстановленная и окисленная форма фосфата
никотинамиддинуклеотида
2-КГ - 2-кетоглутарат
РРР - пентозофосфатный путь метаболизма сахаров ПЦР - полимеразная цепная реакция
Использовались общепринятые сокращенные названия антибиотиков, а также аминокислот как в свободном виде, так и находящихся в виде аминокислотных остатков в составе белков.

При полном или почти полном отсутствии сульфат-иона в среде роста клетки кишечной палочки пытаются использовать органические источники окисленной серы - сульфонаты (R-C-S03H), происходит индукция соответсвующих генов (например, tauABCD и ssuEADCB). Для этого тоже нужна активированная форма CysB, но этого не достаточно. Требуется еще один регуляторный белок-активатор, СЫ, по структуре подобный белку CysB, для экспрессии которого также нужен активированный белок CysB [59, 60]. Как оказалось, СЫ, теряет свою активность индуктора под действием продукта первой реакции в пути восстановления сульфата аденозин-5-фосфосульфата (APS) [57]. Таким образом, усвоение серы и связанного с этим синтеза цистеина находится под действием двухуровневой регуляции генной
активности: NAS активирует белок CysB, который запускает экспрессию
генов сульфатредукции при росте на сульфате; при истощении запаса сульфата белок СЫ активирует гены, необходимые для усвоения сульфонатов.
Белок CysB относят к группу регуляторов транскрипции типа LysR. Тетрамерная форма белка CysB [61] связывается со специфическими сайтами в промоторах генов Cys-регулона [8,12, 62-64]. Таких сайтов может быть от 1 до
3-х в районе дистальнее -35 промоторов. Нуклеотидные последовательности сайтов связывания CysB имеют слабое сходство между собой, однако последовательность из 19 нуклеотидов левой половины частично зеркально симметрична последовательности в правой половине. Между этими симметричными последовательностями расстояние может быть различным. Как удалось выяснить в экспериментах in vitro, связывание белка CysB вызывает изгиб ДНК промотора на 100 градусов. Полагают, что это препятствует работе РНК-полимеразы. При добавление NAS угол изгиба уменьшается в два раза, и это активирует транскрипцию, то есть NAS вызывает изменения конформации белка, что и приводит к уменьшению угла изгиба ДНК. Отмечается также некоторый сдвиг места посадки белка: в присутствии NAS белок CysB защищает от ферментативного гидролиза несколько сдвинутую дальше от