Изучение интерактома протеинкиназы MAK-V с целью характеризации ее функциональных свойств

• Автор: Калиниченко, Светлана Викторовна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Семейство ЛМРК-подобных протеинкиназ
2.1.1. Протеинкиназы AMPK/SNFl/SnRKl
Строение и регуляция АМРК
Функции AMPK/SNFl/SnRKl
2.1.2. Протеинкиназы MARK/Par
Строение MARK
Регуляция MARK
Функции МARK/Par
2.1.3. Протеинкиназы BRSK/SAD
2.1.4. Протеинкиназы NUAK
2.1.6. Протеинкиназы SIK
2.1.7. Протеинкиназа MELK
2.1.8. Протеинкиназы NIM 1 и SNRK
2.1.9. Протеинкиназа MAK-V/HUNK
Функции МАК-V
Участие МАК-V в онкогенезе
2.2. Убиквигин-лигазы Nedd4 и Nedd
2.2.1. Убиквитинирование белков
2.2.2. Семейство Nedd4-noflo6Hbix убиквитин-лигаз
2.2.3. Идентификация и строение Nedd4
2.2.4. Функции Nedd4
Регуляция стабильности и активности внутриклеточных белков
Регуляция мембранных рецепторов, ионных транспортеров и ассоциированных с
мембранами белков
Сортировка транспортируемых белков
Участие в вирусном почковании
2.2.5. Функции и регуляция убиквитин-лигазы Nedd
2.3. Актин-связывающий белок синаптоподин
3. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ
4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4.1. Реактивы
4.2. Бактериальные штаммы, среды, антибиотики
4.3. Приготовление компетентных клеток E.coli
4.4. Трансформация компетентных клеток E.coli
4.5. Выделение плазмидной ДНК
4.6. Электофорез ДНК в агарозном геле
4.7. Плазмидные конструкции
4.7.1. Конструирование плазмид для in vitro транскрипции Nedd4 и Nedd4(C854S)
4.7.2. Конструирование плазмид для продукции белков как химер с глутагион-S-трансферазой в E.coli
4.7.3. Конструирование плазмид для продукции микроРНК к гену Nedd4
4.7.4. Плазмиды для анализа белок-белковых взаимодействий в дрожжах
4.8. Секвенирование
4.9. Электрофорез белков в денатурирующем полиакриламидном геле
4.10. Вестерн-блот анализ
4.11. Получение бактериальных лизатов, содержащих рекомбинантные белки GST, GST-Nedd4 и GST-C-MAK-V
4.12. Анализ GST-пулл-даун
4.13. Получение аффинного матрикса с иммобилизованным С-концевым фрагментом протеинкиназы МАК-V
4.14. Получение фракции периферических мембран
4.15. Аффинная очистка белков на матриксе GST-C-MAK-V
4.16. Масс-спектрометрический анализ
4.17. Анализ связывания белков из фракции периферических мембран головного мозга мыши с полноразмерной протеинкиназой МАК-V
4.18. Получение и очистка анти-MAK-V антител
4.19. Культивирование клеток, трансфекция
4.20. Количественный анализ уровня белка MAK-V-FLAG в клетках, обработанных циклогексимидом
4.21. Биохимическое фракционирование клеток
4.22. Получение суммарного клеточного лизата
4.23. Очистка протеинкиназы MAK-V-FLAG и взаимодействующих с ней белков из клеток PC12TetOn
4.24. Ко-иммунопреципитация MAK-V-FLAG за анти-№бб4-антитела

4.25. Ко-иммунопреципитация эндогенной протеннкиназы МАК-V за aimi-NedcM-антитсла и эндогенной убиквитип-лигазы Nedd4 за анти-МАК-V-антитсла
4.26. Анализ убиквитиннрования in vitro
4.27. Иммуноцитохимнческий анализ
4.28.Эксперименты с использованием дрожжей
4.28.1 Штаммы дрожжей
4.28.2. Среды и реактивы для культивирования дрожжей
4.28.3. Трансформация дрожжей плазмидной ДНК
4.28.4. Анализ мембранной локализации протеннкиназы МАК-V в дрожжах
4.28.5. Анализ взаимодействия МАК-V и синаптоподина в дрожжевой двугибридной системе
4.28.6. Анализ взаимодействия белков МАК-V и Nedd4 в дрожжевой двугибридной системе
4.29. Эксперименты с использованием эмбрионов X. laevis
5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
5.1. Изучение влияния протеннкиназы МАК-V на статус фосфорилирования кофилина 1 и активацию сигнальных путей протеинкиназ ERK1/2 и Akt в клетках PC12TetOn с индуцибельной экспрессией протеннкиназы МАК-V
5.2. Мембранная локализация нротсинкиназы МАК-V
5.2.1. Биохимическое фракционирование клеток с индуцированной экспрессией протеннкиназы МАК-V
5.2.2. Эндогенный белок МАК-V ассоциирован с клеточными мембранами
5.2.3. Мембранная локализация протеннкиназы МАК-V в дрожжах
5.3. Взаимодействие протеннкиназы МАК-V с синаптоподином
5.3.1. Очистка и идентификация белков, взаимодействующих с С-концевым доменом протеннкиназы MAK-V
5.3.2. Установление аутентичности белков и анализ специфичности взаимодействия с С-концсвым доменом МАК-V
5.3.3. Взаимодействие синаптоподина с полноразмерной протеинкииазой МАК-V
5.4. Взаимодействие протеннкиназы МАК-V и убиквитин-лигазы Ncdd4
5.4.1. Идентификация Nedd4 как белка-партнера но взаимодействию с протеинкииазой МАК-V
5.4.2. Картирование взаимодействия между МАК-V и Nedd4
5.4.3. МАК-V подвергается нротеасомной деградации

2.2.2. Семейство NeihU-подобныхубиквштш-лигаз
Вес идентифицированные убиквитин-лигазы подразделяются на две группы. Первая группа содержит RING (Really interesting new йепе)-домен типа «цинковые пальцы». RING-убиквитин-лигазы лишь обеспечивают пространственное сближение конъюгирующего фермента Е2 и белка-субстрата. Вторая группа, содержащая МЕСТ (Homologous to Е6-АР carboxy terminus)moMeH, переносит убиквнтин на субстрат с образованием промежуточного тиолэфирного интермедиата ЕЗ-Б-убиквитин [147]. К этой группе относится семейство Nedd4-no;to6iibix убиквитин-лигаз, состоящее у человека из 9 белков: Nedd4, Ncdd4-2 (Nedd4L), AIP4/Itch, Smurfl, Smurfi, WWP1, WWP2, NedLl и NedL2. Белки Nedd4 и Nedd4-2 являются наиболее близкими гомологами.
Филогенетический анализ показывает, что убиквитин-лигаза Nedd4 является самым древним членом этого семейства. Белок Nedd4 наиболее близок к Rsp5, единственному представителю Ncdd4-no;ro6nux протеинкнназ в Schizosaccharomyces cerevisiae. В D. melanogaster идентифицированы уже 4 члена семейства, включая dNedd4, но не ортолог Nedd4-2. Убиквитин-лигаза Nedd4-2 появляется в процессе эволюции лить у позвоночных, как предполагается, в результате дупликации гена. Nedd4 и Nedd4-2 характеризуются одинаковой специфичностью к убиквитин-конъюгирующим ферментам Е2 [148]. По данным последних исследований, Nedd4 характеризуется большим разнообразием субстратов и является важным регулятором клеточного роста, дифференцнровки и эмбрионального развития, a Nedd4-2 контролирует преимущественно интернализацию ионных каналов и транспортеров.
2.2.3. Идентификация и строение Nedd4
Убиквитин-лигаза Nedd4 (Neuronal precursor cell expressed developmentally down-regulated 4) была идентифицирована в результате клонирования транскриптов головного мозга мышиных эмбрионов [149]. Впоследствии ортологи Nedd4 были обнаружены во всех эукариотических организмах. Экспрессия гена Nedd4 в центральной нервной системе млекопитающих достигает наивысшего уровня во время эмбрионального нейрогепеза и в период активного формирования синапсов в раннем постнатальном развитии [150]. В эмбрионах млекопитающих транскрипт гена Nedd4 детектируется также в сердце, легких, почечных канальцах, желудочно-кишечном тракте, поджелудочной железе, репродуктивных органах, молочной железе, селезенке и позвоночнике [151]. О ключевой роли убиквитин-лигазы Nedd4 в пренатальном развитии свидетельствует тот факт, что эмбрионы мышей с генотипом Nedd4-/- погибали в середине развития и