Исследование роли рибосомных белков L5 и L25 в формировании функционально-активной бактериальной рибосомы

• Автор: Коробейникова, Анна Васильевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 167 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. РИБОСОМНЫЕ БЕЛКИ: СВОЙСТВА, СТРУКТУРА И ЭВОЛЮЦИЯ
1.1. Рибосомные белки трех доменов жизни: разнообразие, сходство и различия
1.2. Структурные особенности рибосомных белков, отражающие их свойства
2. Роль БЕЛКОВ В СБОРКЕ ФУНКЦИОНАЛЬНО-АКТИВНОЙ РИБОСОМЫ
2.1. Сборка малой субчастицы рибосомы
2.2. Сборка большой субчастицы рибосомы
2.3. Участие белков в ассоциации рибосомных субчастиц
3. Участие бежов в формировании функциональных центров рибосомы
3.1. Элонгационный цикл и функциональные центры рибосомы
3.2. Связывание мРНК
3.3. Декодирующий центр
3.4. Петпидилтрансферазный центр
3.5. тРНК-связываище участки
3.5.1. А-участок
3.5.2. Р-участок
3.2.3. Е-участок
3.6. Участок связывания белковых факторов трансляции
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Материалы и приборы
1.1. Химические реактивы и ферменты
1.2. Микробиологические среды
1.3. Штаммы и плазмиды
1.4. Буферы
1.5. Принадлежности
1.6. Приборы
2. Методы генной инженерии, молекулярной генетики и микробиологии

2.1. Общие методы
2.1.1. Выделение хромосомной ДНК
2.1.2. Полимеразная цепная реакция
2.1.3. Обработка ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами
2.1.4. Лигирование ДНК
2.1.5. Получение компетентных клеток E. coli и их трансформация методом теплового шока
2.1.6. Анализ бактериальных колоний на наличие рекомбинантной плазмиды
2.1.7. Выделение плазмидной ДНК
2.1.8. Осуществление замен в хромосомной ДНК E. coli с помощью метода «recombineering»
2.1.9. Общая трансдукция бактериофагом Р
2.1.10. Определение времени удвоения клеток E. coli
2.1.11. ß-галактозидазный тест
2.2. Клонирование и секвенирование генов исследуемых РНК, белков и их мутантных

2.2.1. Секвенирование фрагмента хромосомной ДНК A. aeolicus
2.2.2. Клонирование гена 5S рРНК и его фрагментов
2.2.3. Клонирование генов белков СТС A. aeolicus, E.faecalis и Nostoc sp
2.2.4. Направленный мутагенез N-концевого домена белка TL5 Т. thermophilus
2.2.5. Направленный мутагенез белков L5 и L25 E. coli
2.3. Экспрессия генов исследуемых белков в клетках E. coli
2.4. Создание штаммов E. coli для исследований и работа с ними
2.4.1. Создание штаммов E. coli, содержащих в хромосоме мутантную форму гена исследуемого белка
2.4.2. Получение клеток E. coli, дефицитных по рибосомному белку L
3. Биохимические методы
3.1. Электрофоретические методы анализа нуклеиновых кислот, белков и РНК-
белковых комплексов
3.2. Выделение и очистка исследуемых белков из штаммов-продуцентов E. coli.
3.3. Получение препаратов исследуемых РНК
3.3.1. Выделение 5S рРНК E. coli
3.3.2. Синтез 5S рРНК и ее фрагментов транскрипцией in vitro и их очистка

3.3.3. Подготовка образцов РНК к экспериментам
3.3.4. Фракционирование клеточных РНК E. coli
3.4. Методы исследования РНК-белковых комплексов
3.5. Выделение и анализ препаратов рибосом и рибосомных субчастиц
3.5.1. Выделение рибосом и рибосомных субчастиц из клетбк E. coli
3.5.2. Анализ препаратов рибосом и рибосомных субчастпц центрифугированием в градиенте плотности сахарозы
3.6. Методы исследования функциональной активности рибосом in vitro
3.6.1. Получение тотальной ферментной фракции из клеток E. coli
3.6.2. Трансляция полиуридиловой матрицы
3.6.3. Трансляция мРНК люциферазы в бесклеточной системе из E. coli
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Изучение специфического взаимодействия рибосомного белка L25 Escherichia
COLI И ЕГО ГОМОЛОГОВ (БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА СТС) С 5S РРНК
1.1. Белок СТС Aquifex aeolicus не является исключением среди белков семейства
1.2. Роль отдельных аминокислотных остатков белков L25 и TL5 в формировании и
стабилизации их комплекса с 5SрРНК
1.3. РНК-связывающие свойства белков СТС с природными заменами в их 5SрРНК-
связывающем модуле
2. Необходимость взаимодействия белка L25 c5S рРНКдля его встраивания в
РИБОСОМУ IN VIVO
3. Исследование роли рибосомного белка L5 в сборке и функционировании
рибосомы Escherichia coli
3.1. Получение и характеристика больших рибосомных субчастиц, собранных in vivo в
отсутствие белка L
3.2. Влияние мутаций в петле ß2-ß3 белка L5 на синтез рибосомами полипептида.
in vivo и in vitro
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

субчастицу in vivo были получены несколько отличные результаты (Pichon et al., 1975).
В первом интермедиате сборки in vitro 50S субчастицы обнаруживается приблизительно 20 рибосомных белков (Рис. 11). Оказалось, что для максимальной компактизации 23S рРНК достаточно только 9-10 из них (Hindennach et al., 1971; Kuhlbrandt & Garrett, 1978; Сердюк и др., 1984; Gongadze et al., 1986). А для конформационного перехода RI50(1) —> RI50*(1) были строго необходимы только пять - L4, L13, L20, L22, L24 (Spillmann et al., 1977). Эти белки связываются с 5'-концевой частью молекулы 23S рРНК (Chen-Schmeisser & Garrett, 1976) и обнаруживаются в первом предшественнике 50S субчастцы in vivo (Nierhaus et al., 1973). Эти наблюдения способствовали появлению такого понятия как «градиент сборки» (имеется в виду то, что направление транскрипции рибосомных РНК от 5'- к 3'-концу определяет последовательность этапов сборки рибосомных субчастиц) (Sieber & Nierhaus, 1978). Белок L3, взаимодействующий с З'-концевой частью молекулы 23S рРНК (Chen-Schmeisser & Garrett, 1976), имеет стимулирующую активность, но его присутствие не является обязательным.
Было отмечено, что более половины белков, необходимых для перехода Rl5oO)~_>Rl50*(l)> содержит выступающие из глобулярных доменов длинные петли или «хвосты» (Klein et al., 2004). Это позволило авторам предположить, что эти структурные элементы белков могут быть важны для ранних этапов сборки 50 S субчастицы. Для некоторых белков это предположение было проверено экспериментально (для обзора см. Timsit et al., 2009). Оказалось, что сборка 50S субчастиц в клетках E. coli, содержащих белок L4 или L22 без указанных элементов, не нарушена (Zengel et al., 2003). Это говорит о том, что глобулярные части белков L4 и L22 достаточны для выполнения этими белками их функций во время сборки большой субчастицы рибосомы. Только в случае белка L20 было показано, что удлиненная N-концевая а-спираль этого белка необходима для формирования 50S субчастицы (Guillier et al., 2005). Таким образом, важность указанных структурных элементов рибосомных белков для сборки 50S субчастицы имеет скорее исключительный, чем общий характер. Данное заключение подтверждается тем, что все первично-связывающиеся белки малой рибосомной субчастицы являются типичными глобулярными белками (Brodersen et al., 2002).