Синтез в растениях поверхностного антигена вируса гепатита B: повышение биологической безопасности трансгенных растений

• Автор: Пучко, Елена Николаевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 108 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Использование трансгенных растений в качестве продуцентов антител, вакцин и терапевтически ценных белков
1.1.1. Синтез биофармацевтических белков в трансгенных растениях
1.1.2. Производство антител с помощью трансгенных растений
1.1.3. Вакцины на основе трансгенных растений
1.2. Синтез гена поверхностного антигена вируса гепатита В
в различных растительных системах
1.2.1. Вирус гепатита В, этиология вируса и его структурные компоненты
1.2.2. Вакцины против гепатита В на основе растений
1.2.3. Выбор растительных систем экспрессии и методов трансформации
1.2.4. Оптимизация экспрессии HBsAg в рекомбинантных растительных системах
1.2.5. Структурная характеристика НВзА§, синтезированного в трансгенных растениях
1.2.6. Исследования иммуногенности НВзА£, синтезируемого трансгенными растениями
1.3. Повышение биологической безопасности трансгенных
растений
1.3.1 .Получение безмаркерных трансгенных растений

1.3.1.1. Использование трансформации растений без селективных маркеров устойчивости
1.3.1.2. Метод котрансформации
1.3.1.3. Сайт-специфическая рекомбинация
1.3.1.4. Метод получения безмаркерных растений с использованием транспозонов
1.3.1.5. Использование векторной системы МАТ для получения безмаркерных растений
1.3.1.6.Удаление маркерных генов из хлоропластов растений
1.4.3аключение
2. Материалы и методы
2.1. Объекты исследования
2.2. Штаммы бактерий и плазмиды
2.3. Микробиологические среды
2.4. Среды для культивирования растений
2.5. Растворы и буферы
2.6. Ферменты, использованные в работе
2.7. Выделение, очистка и манипуляции с плазмидной ДНК
2.8. Конструирование плазмид для трансформации растений
2.9. Введение метки в ДНК
2.10. Скрининг рекомбинантных клонов гибридизацией на фильтрах
2.11. Гибридизация на фильтрах по Саузерну
2.12. Трансформация листовых эксплантов табака
2.13. Трансформация семян табака и томата с помощью вакуумной инфильтрации
2.14. Выделение суммарной растительной ДНК для ПЦР-анализа
2.15. Электрофорез в агарозном геле
2.16. ПЦР-анализ ДНК трансгенных растений
2.17. Выделение белка из тканей растений
2.18. Определение белка в растительных экстрактах
2.19. Иммуноферментный анализ
2.20. Оральная иммунизация мышей клубнями трансгенного картофеля
2.21. Измерение количества антител к НВзА§ в сыворотке
крови иммунизированных мышей
3. Результаты и обсуждение
3.1.Получение трансгенных растений, экспрессирующих ген HBsAg под контролем комбинированных агробактериальных
промоторов
3.2.0птимизация экспрессии гена HBsЛg в трансгенных
растениях
3.3. Получение безмаркерных трансгенных растений с геном
HBsAg
3.4. Иммуногенность поверхностного антигена вируса гепатита В, синтезируемого трансгенными растениями
картофеля
Заключение
Выводы
Список использованной литературы

разработан новый метод прямого отбора трансгенных растений, основанный на детекции иммунологическими методами их целевых продуктов (Рукавцова и др., 2009 а,б)
1.3.1.1. Использование трансформации растений без селективных маркеров устойчивости
В этом случае генномодифицированные растения получают путем агробактериальной трансформации, с последующей регенерацией побегов без использования маркеров селективной устойчивости. Это приводит к огромному количеству растений, большинство из которых не будет трансгенными. Однако в зависимости от регенерации и частоты передачи гена, некоторые проростки будут трансгенными и могут быть идентифицированы, например, ПЦР-анализом. Этот метод ограничен модельными растениями и малым количеством специфичных урожайных сортов, например, картофелем (Эе Уейеп Щ а1., 2003).
1.3.1.2. Метод котрансформации
Котрансформация представляет собой метод получения безмаркерных растений, основанный на агробактериальной или биобаллистической трансформациях, при этом маркерные гены и ген интереса находятся в разных векторных конструкциях. При котрансформации используется 3 подхода (ОеЫп, 2003; А1Ъ1аЫ П а1., 2005):
1) Использование для трансформации двух Т-ДНК, находящихся в разных штаммах агробактерий, либо внедрение двух плазмид в одну и ту же ткань с помощью биобаллистической установки.
2) Внедрение в геном растения двух Т-ДНК осуществляют с помощью различных репликонов, находящихся в одном штамме агробактерий.