Определение кристаллической структуры мутантных форм рибосомного белка L1 и молекулярно-динамические исследования их комплексов с РНК

• Автор: Кляшторный, Владислав Георгиевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 97 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
Глава 1. Обзор литературы: основные методы исследования структур макромолекул
1.1. Экспериментальные методы
1.2. Рентгеноструктурный анализ, как один из наиболее мощных методов определения пространственной структуры биологических макромолекул
1.2.1. Теоретические основы метода
1.2.2. От кристаллов до конечной модели: основные этапы определения пространственной структуры
1.2.2.1. Выделение, очистка и кристаллизация препарата
1.2.2.2. Сбор и обработка дифракционных данных
1.2.2.3. Проблема фаз и пути ее преодоления
1.2.2.4. Уточнение модели
1.2.3. Характеристики метода и критерии достоверности полученных результатов
1.2.4. Перспективы дальнейшего развития метода
1.3. Теоретические методы
1.3.1. Метод молекулярной динамики как один из наиболее мощных подходов изучения конформационных изменений в биологических системах
1.3.2. Теоретические основы метода
1.3.3. От статики к динамике: основные этапы расчета молекулярно-динамической траектории
1.3.3.1. Подготовка системы
1.3.3.2. Минимизация энергии
1.3.3.3. Уравновешивание системы
1.3.3.4. Расчет молекулярно-динамической траектории
1.3.3.5. Анализ полученных данных
1.3.4. Характеристики метода молекулярной динамики и критерии достоверности полученных результатов
1.3.5. Перспективы дальнейшего развития метода
1.4. Комбинированный подход к исследованию функционирования биологических
макромолекул
Глава 2. Экспериментальная часть
2.1. Объект исследования: общая характеристика белка Ы

2.1.1. Функциональная активность белка Ы
2.1.2. Структурная характеристика белка Ы
2.1.2.1. Ы из Пегтш Ікегторкіїия
2.1.2.2. Ы из МеМапососсш]аппазскіі
2.1.2.3. Две конформации для белков Ы
2.1.3. Взаимодействие между белком Ы и РНК
2.1.3.1. Рибосомный комплекс
2.1.3.2. Регуляторный комплекс
2.1.3.3. Сравнение структур комплексов Ы-мРНК и Ы-рРНК
2.2. Определение пространственных структур мутантных форм белка Ы
2.2.1. Сбор и обработка дифракционных данных
2.3. Молекулярно-динамические исследования белка Ы и его комплексов с РНК
2.3.1. Подготовка системы
2.3.2. Минимизация энергии
2.3.3. Уравновешивание системы
2.3.4. Расчет молекулярно-динамических траекторий
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Анализ кристаллических структур
3.1.1 Анализ структуры изолированного первого домена белка ТЧЫЛ и его комплекса с

3.1.2. Анализ структур мутантных форм рибосомного белка 1Л
3.1.2.1. Точечные замены в МіаІЛ
3.1.2.1. Точечные замены в 'ПЫЛ
3.3. Молекулярно-динамические исследования
3.3.1. Изолированные мутантные формы белка Ы
3.3.2. Комплексы белка Ы и его мутантных форм с фрагментами РНК
Основные результаты и выводы
Список литературы
Благодарности

Введение
Молекулярное узнавание биологических макромолекул на протяжении долгих лет остается одной из основных проблем молекулярной биологии. Как макромолекулы находят и узнают друг друга в клетке? Почему одни белковые комплексы распадаются сразу после образования, а другие сохраняются на протяжении нескольких минут и даже часов? Что определяет стабильность тех или иных комплексов? Вот далеко не полный перечень вопросов, на который еще только предстоит ответить современным исследователям.
Для изучения взаимодействий между РНК и белком обычно используют метод точечных замен в области интерфейса. Однако нельзя заранее предсказать, как каждая замена скажется на структуре молекулы, и поэтому анализ результатов биохимических экспериментов по связыванию во многом носит гипотетический характер. Определение структур мутантных форм белка L1 в свободном состоянии и исследование их комплексов с РНК методами молекулярной динамики позволяют выявить характер внесенных изменений и оценить их влияние на стабильность комплекса. Кроме того, эти данные просто необходимы для корректного анализа экспериментальных результатов по связыванию белка с РНК.
В рамках данной работы на примере комплексов рибосомного белка L1 с различными фрагментами рРНК и мРНК исследуется влияние точечных мутаций на конформацию РНК-связывающего участка белка в свободном состоянии и, как следствие, на образование и стабильность РНК-белкового комплекса, которая оценивается методами молекулярной динамики. Сравнение полученных данных с результатами биохимических экспериментов позволяет выявить структурные принципы, лежащих в основе специфичности РНК-белкового взаимодействия. Предпосылками к данной работе явилось определение пространственных структур белков L1 из Thermits thermophilus (TthLl) и Methanococcus jannaschii (MjaLl) в изолированном состоянии, а также их комплексов с фрагментами рибосомной и матричной РНК [1-5].
Данная диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, а также обсуждения результатов и выводов и содержит в конце список цитируемой литературы. Раздел «Обзор литературы» посвящен описанию основных современных методов изучения пространственной структуры биологических макромолекул. В первой части обзора подробно освещается метод рентгеноструктурного анализа, который был использован в данной работе для определения пространственных

найдены как:

В минимуме сШ(Хтт)/с1х = 0, так ЧТО Хщт может быть вычислен, используя выражение
Для квадратичных поверхностей, таким образом, нет необходимости итеративного поиска, поскольку точное значение минимума может быть определено из текущей конфигурации и производных в этой конфигурации. К сожалению, энергетические поверхности биомолекулярных систем имеют тенденцию быть крайне неквадратичными и также содержат множество локальных минимумов. Это делает основной метод Ньютона-Рафсона менее полезным. Однако этот метод широко используется на завершающих стадиях минимизации после оптимизации, выполненной другими методами. Одна из модификаций этого метода, адаптированный базисный набор Ньютона-Рафсона очень эффективно используется для больших биомолекулярных систем [84].
Минимизированная система содержит «расслабленную» белковую молекулу, окруженную молекулами растворителя и нейтрализованную контрионами, находящимися, как правило, на удалении не менее 5А друг от друга и от белковой поверхности. Следующей стадией молекулярно-динамического исследования является уравновешивание системы.
1.3.3.3. Уравновешивание системы
Уравновешивание системы заключается в расчете относительно короткой молекулярно-динамической траектории после назначения стартовых скоростей при заданной температуре. Этот процесс также зависит от типа используемого программного обеспечения. В широко используемом молекулярно-динамическом пакете СНА11ММ [84] скорости назначаются при температуре близкой к нулю. Затем в систему постепенно добавляют кинетическую энергию, плавно увеличивая температуру. Целью этой процедуры является равномерное распределение добавочной энергии по всем степеням свободы системы. На этой стадии также осуществляется релаксация водного окружения и самой белковой молекулы. Атомы находят и занимают близкие к равновесным положения. Продолжительность этой стадии зависит от размера исследуемой системы и может несколько варьировать, но, как правило, для большинства биомолекулярных систем времени порядка 100 пикосекунд достаточно для полного распределения