Внутриклеточные перемещения белков антиоксидантного комплекса. Новая система локализационных репортеров

• Автор: Чумаков, Степан Петрович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 83 с. : ил.

Оглавление
Оглавление
Список используемых сокращений
Глава 1. Организация и регуляция транспорта между цитоплазмой и ядром
Введение
Кариоферины и их роль в организации ядерно-цитоплазматического транспорта
ГТФаза Ran и Ran-зависимый транспорт
Транспорт рецепторов стероидных гормонов
Нуклеопорины, их строение и функции
Транспортные функции Nup98
Модели функционирования NPC
Транслокация трансмембранных белков на внутреннюю ядерную мембрану
Иерархическая регуляция ядерного транспорта
Регуляция на уровне отдельного груза
Внутримолекулярное маскирование NLS/NES
Межмолекулярное маскирование NLS/NES
Модуляция аффинности к кариоферинам посттранскрипционной
модификацией
Модуляция аффинности к кариоферинам путем посттрансляционной
модификации
Удержание в цитоплазме или ядре
Регуляция на уровне транспортных рецепторов
Модуляция экспрессии компонентов нуклеоцитоплазматической
транспортной системы
Роль импортинов в гаметогенезе
Роль экспортинов в процессе развития организма
Регуляция на уровне компонентов NPC
Роль нуклеопоринов и других модуляторов ядерного транспорта
в процессе развития
Роль нуклеопоринов в митозе
Роль нуклеопоринов в онкогенезе и развитии вирусной инфекции
Глава 2. Материалы и методы
Используемые клеточные линии, их культивирование и обработка
Селекция клеточных культур после трансдукции лентивирусными конструктами40
Измерение концентрации белка по методу Бредфорд
Фракционирование белков в полиакриламидном геле
Перенос белков из гелей на фильтры и иммунодетекция
Получение компетентных клеток E.coli и трансформация
Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК
Обработка ДНК рестрикционными эндонуклеазами
Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей
Реакция лигирования
Трансфекция лентивирусных и плазмидных конструктов и получение
клеточных линий
Иммунофлуоресценция
Определение активности (3-галактозидазы при помощи системы GalScreen®
Определение уровней внутриклеточных ROS на FACS при помощи DCF-DA
Получение экспрессионных лентивирусных конструктов
Этапы клонирования ш-конструкта
Этапы клонирования а-конструктов

Получение а-конструктов, экспрессирующих мутантные
варианты Sesn2 с перманентно-активированными и перманентно-
репрессированными сайтами фосфорилирования
Получение конструктов, одновременно экспрессирующих несколько shPHK,
специфичные к различным генам
Глава 3. Резульаты и обсуждение
Принцип действия и структура локализационного репортера
Конструирование вектора для экспрессии ш-пептида
Конструирование векторов для экспрессии белков, слитых с а-пептидом
Получение клонов oü-nuc-bleo
Отработка функционирования репортера на примере белка FOX03A
Влияние обработки hTNF и культивации в среде без сыворотки на изменение
внутриклеточной локализации белка Sesn2
Перемещения Sesn2 в митохондрии и к плазматической мембране при
окислительном стрессе
Влияние сульфиредоксина на передислокацию Sesn2
Переход Sesn2 в ядро под действием РМА
Исследование механизмов РМА-индуцированной передислокации Sesn2
Влияние сайтов фосфорилирования белковой молекулы Sesn2 на динамику
ядерной транслокации
Заключение
Выводы
Список литературы

Список используемых сокращений

Ala Alanine Аланин
APC Anaphase Promoting Complex Циклосома
BSA Bovine Serum Albumin Бычий сывороточной альбумин
CKII Casein Kinase II Казеинкиназа II
CTE Constitutive Transport Element Конститутивный транспортный элемент
Cys Cysteine Цистеин
DCF 2',7'-dichlorofluorescin 2',7'-дихлорфлуоресцин
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Среда Игла в модификации Дульбеко
DMSO Dimethyl Sulfoxide Диметилсульфоксид
DPI Diphenyleneiodonium chloride Дифенилиод хлорид
EBSS Earle’s Balanced Salt Solution Сбалансированный солевой раствор Эрла
EGF Epidermal Growth Factor Эпидермальный ростовой фактор
EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein Модифицированный зеленый флуоресцентный белок
EGFR Epidermal Growth Factor Receptor Рецептор эпидермального ростового фактора
ER Endoplasmic Reticulum localization signal Сигнал эндоплазматической локализации
FACS Fluorescence-Activated Cell Sorter Проточный цитофлуориметр
FCS Fetal Calf Serum Фетальная телячья сыворотка
FG Fenilalanine-Glycine Фенил аланин-глициновый (домен; повтор)
FITC Fluorescein isothiocyanate Флуоресцин изотиоцианат
FRET Fluorescence Resonance Energy T ransfer Резонансный перенос энергии флуоресценции
GAG Group-specific antigen Антиген Групповой специфичности
GFP Green Fluorescent Protein Зеленый флуоресцентный белок
HIV Human Immunodeficiency Virus Вирус иммунодефицита человека
hTNF Human Tumor Necrosis Factor Фактор некроза опухолей человека
IGF1 Insulin-like Growth Factor Инсулин-подобный фактор роста
INM Inner Nuclear Membrane Внутренняя ядерная мембрана
Kaps Karyopherins Кариоферины
LB Lysogeny Broth Лизогенный бульон
LTR Long Terminal Repeat Длинный концевой повтор
Mem Membrane localization signal Сигнал локализации на плазматической мембране
Mit Mitochondrial localization signal Сигнал митохондриальной локализации
MOPS 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid 3--морфолино)пропансульфоновая кислота
NAC N-acetyl-cysteine ацетил-цистеин
NES Nuclear Export Signal Сигнал ядерного экспорта
NF-AT2 Nuclear factor of activated T-lymphocytes 2 Ядерный фактор активированных Т-лимфоцитов №2
NLS Nuclear Localization Signal Сигнал ядерной локализации
NOX NADPH Oxidase 4 НАДФ-Н оксидаза
в течение всей митотической фазы развития сперматид, а на стадии элонгации сперматид его синтез затухает [191]. Импортин-а2 активно синтезируется в течение первых четырех митозов сперматогоний и двух последующих мейозов. У мух с мутантным импортином-а2 (1тр-а2014) снижена фертильность. Повышенный уровень импортинов-а1 и -аЗ у трансгенных мух может восстановить фертильность у самцов, что говорит о способности этих импортинов частично брать на себя функции импор-тина-а2 в ходе сперматогенеза. Однако фертильность мутантных самок 1тр-а2014 при высоком уровне других импортинов не восстанавливается, что свидетельствует о ключевой роли импортина-а2 в процессе оогенеза [192].
Импортины СаепогЬаЬсИИз е/едапз также по-разному синтезируются в клетках разного типа. Импортины-а1 и -а2 в основном представлены в половых клетках, а импортин-аЗ присутствует и в соматических клетках. Подавление синтеза импорти-на-аЗ при помощи РНК-интерференции блокирует мейоз на стадии пахитены. По-видимому, импортины-а1 и -а2 не способны компенсировать отсутствие импортина-аЗ, что говорит о необходимости импортина-аЗ для успешного прохождения мейоза. Ингибирование импортина-а2 приводит к анеуплоидии, неправильной организации хроматина в ходе клеточного деления и неполному восстановлению ядерной мембраны после мейоза [193].
Различные импортины критически необходимы низшим эукариотам в ходе гаме-тогенеза, что говорит о важности правильной организации ядерного транспорта для мейоза.
Роль экспортинов в процессе развития организма
Исключительная важность Сгт1 -зависимого ядерного экспорта в процессе развития показана в опытах с лептомицином В — специфическим ингибитором Сгт1. Обработка лептомицином гонад мышиных эмбрионов с генотипом XX в ходе первичных этапов установления половой принадлежности приводила к развитию мужского фенотипа после четырех дней культивации [194]. В клеточных ядрах повышалась концентрация хроматин-ремоделирующего фактора ЭОХЭ, что, очевидно, связано с необходимостью Сгт1 для вывода этого фактора в цитоплазму.
В отличие от Сгт1 и импортинов-(32 и -33, которые присутствуют во всех клетках дрозофилы, экспортин бСАБ, отвечающий за возвращение находящегося в ядре им-портина-а в цитоплазму, по-разному представлен в различных тканях. Он практически не синтезируется в середине стадии бластодермы. Позже его содержание возрастает, особенно в эмбриональных нервных клетках. Мутации в сЮАБ приводят либо к летальному фенотипу, либо, в случае гипоморфного сЮАБ, к дефектам развития нервной системы. Эти дефекты развития, по-видимому, вызваны недостатком цитоплазматического импортина-аЗ и обусловленной этим низкой концентрацией Моб-регулируемого белка Би9(Н) в ядре [195].