Идентификация онко-ассоциированных генов при светлоклеточном раке почки

• Автор: Снежкина, Анастасия Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 145 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста

1.1.1. Ген ИЕ'Ю2 - потенциальный онкоген СРП

1Л .2. Ген N110112 - потенциальный супрессор СРП

1.2. Энергетический обмен в опухолевых клетках

1.2.1. Гликолиз

1.3. Метаболизм ретинола и его нарушение при раке

1.3.1. Ретинол

1.3.2. Метаболизм ретинола в клетке

1.3.3. Механизм действия рецепторов ретиноидов

1.3.4. Экспрессия генов, кодирующих ферменты биосинтеза ретиноевой кислоты
1.3.5. Биологическая роль продуктов метаболизма ретинола
1.4. Способы эпигенетической регуляции экспрессии генов
1.4.1. МикроРНК
1.4.2. Метилирование
1.4.3. Модификации гистонов
1.5. Методы оценки уровня мРНК генов
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материалы
2.1.1. Образцы тканей
2.2. Методы исследований
2.2.1. Выделение нуклеиновых кислот
2.2.2. Реакция обратной транскрипции
2.2.3. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
2.2.4. Математическая обработка данных ПЦР-РВ
2.2.5. Анализ метилирования
2.2.6. Подготовка библиотек микроРНК
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка методической базы для Г1ЦР-РВ
3.2. Биоинформатический анализ экспрессии генов, кодирующих ферменты гликолиза
3.2.1. Количественная оценка относительного уровня мРНК генов, кодирующих ферменты гликолиза
3.3. Биоинформатический анализ экспрессии генов, кодирующих компоненты метаболизма ретинола
3.3.1. Количественная оценка относительного уровня мРНК генов, кодирующих компоненты метаболизма ретинола
3.4. Бионформатический поиск потенциальных молекулярных маркеров СРП
3.4.1. Количественная оценка относительного уровня мРНК гена МЕТ02 и регуляция его экспрессии
3.4.2. Количественная оценка относительного уровня мРНК гена N110132 и регуляция его экспрессии
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а.о. - аминокислотные остатки
п.н. - пар нуклеотидов
и.о. - пар оснований
т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов
ДІІК - дезоксирибонуклеиновая кислота
кДІІК - комплиментарная ДНК
мРНК - матричная РНК
микроРНК - малая РНК размером 19-25 нуклеотида ОТ - реакция обратной транскрипции РП - рак почки
СРП - светлоклеточный рак почки
НМРЛ - немелкоклеточный рак легкого
ПРЛ - плоскоклеточный рак легкого
ГЦК - гепатоцеллюлярная карцинома
РМЖ - рак молочной железы
РЖ - рак желудка
РЩЖ - рак щитовидной железы
РТК - рак толстой кишки
ЯРР - ядерные рецепторы ретиноидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
НАД - никотинамидадениндинуклеотид
АМФ - аденозинмонофосфат
АДФ - аденозиндифосфат
АТФ - аденозинтрифосфат
ГТФ - гуанозинтрифосфат
ГДФ - гуанозиндифосфат
БЭИ - биоэнегретический индекс
Ацетил-коА - ацетил кофермент А
цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

(Gibson et al., 1996; Heid et al., 1996; Лукьянов и др., 1999; Брага и др., 2003; Ребриков и др., 2009).
Высокопроизводительное секвенирование (NGS, Next Generation Sequencing)
на платформе Illumina (США). Для измерения экспрессии генов на уровне транскрипции этот метод также как и большинство остальных, требует предварительной конверсии мРНК в кДНК с помощью обратной транскриптазы. Полученную кДНК, случайным образом фрагментируют на участки длиной 100-150 пар оснований. Затем комплементарные цепи фрагментов разделяют, к каждой цепи добавляют олигонуклеотид-индекс, который позволяет отдельным цепям прикрепляться к комплементарным адаптерам на проточной ячейке. Последовательность этого олигонуклеотида-адаптера позднее, в процессе секвенирования, позволяет распознать кДНК-матрицу. Далее проводят секвенирование. На платформе Illumina каждый цикл секвенирования проходит с использованием четырех меченых специфическими флуорофорами нуклеотидов 3’-конец которых заблокирован, что не позволяет включать ДНК-полимеразе в синтезируемую цепь более одной буквы за цикл. Весь цикл состоит из нескольких этапов: 1) внесение всех типов нуклеотидов на проточную ячейку, 2) включение полимеразой одного комплементарного каждому кластеру нуклеотида, 3) детекция флуоресценции, 4) снятие 3’-блока вместе с флуорофором. При этом проводят детекцию флуоресцентного сигнала, уникального для каждого нуклеотида. В результате получаются известные последовательности, прочитанные с одной стороны или двух сторон. Далее данные сиквенса обрабатываются биоинформатически. Этот метод позволяет анализировать десятки миллионов фрагментов мРНК размером до 200 п.н., количественно оценивать их содержание, идентифицировать альтернативные транскрипты, полиморфизмы и мутации (в г.ч. транслокации). Основными недостатками метода секвенирования на платформе Illumina являются: высокая стоимость,
трудоемкость, необходимость биоинформатического анализа данных и подтверждение полученных результатов методом ПЦР-РВ (Liu et al., 2012; Blomquist et al., 2013).
Таким образом, существует множество методов оценки экспрессии генов на
уровне мРНК, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки.
Исследователи должны выбирать метод в соответствии с поставленными задачами.
Например, метод ПЦР-РВ и метод высокопроизводительного секвенирования в отличие
от прочих, позволяют быстро и с высокой точностью количественно оценивать