Специфические особенности инициации трансляции на РНК вируса гепатита С

• Автор: Бочкаева (Адьянова), Занда Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 85 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

1. Инициация трансляции у эукариот

1.1 Кеп-зависимый механизм инициации трансляции

1.2 IRES-зависимые механизмы инициации трансляции

1.3 5’-зависимая трансляция намРНК, содержащих гепатитный и гепатитоподобный 1RES

2. Вирус гепатита С

2.1 Геномная организация вируса гепатита С

2.2 1RES вируса гепатита С

2.3 Белки 40S субчастицы рибосомы, взаимодействующие с 1RES’ом вируса гепатита С: белок р40
2.3.1 Белок малой субчастицы рибосомы р40
2.4 Домен I 5’-нетранслируемой области мРНК HCV
2.5 Регуляция трансляции на мРНК вируса гепатита С
2.5.1 Регуляция трансляции мРНК вируса гепатита С: клеточные белки:
Антиген La
Полипиримидиновый тракт-связывающий белок (РТВ)
Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин L (hnRNP L)
Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин D (hnRNP D)
Белок, ассоциированный с NSI 1 (NSAP 1)
Белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 2 (IGF2BP1)
2.5.2 Регуляция трансляции мРНК вируса гепатита С: вирусные белки:
Белок core
Неструктурные белки 4А и 4В
2.5.3 Регуляция трансляции мРНК вируса гепатита С: РНК-структуры: Специфическая печеночная микроРНК miR
2.6 З’-нетранслируемая область

Результаты и обсуждение
1. Инициация трансляции на мРНК вируса гепатита С: роль рибосомного белка р40 в связывании ЖЕБ-элемента с 408 субчастицей рибосомы
1.1 Изучение влияния белка р40 на образование бинарного комплекса между ШЕ8-элементом вируса гепатита С с 40Б субчастицей рибосомы
1.1.1 Получение белка р40
1.1.2 Исследование малых субчастиц рибосом на наличие белка р40 и насыщение им
1.1.3 Исследование влияния р40 на эффективность связывания малых субчастиц рибосом с мРНК вируса гепатита С
1.2 Исследование необходимости белка р40 для трансляции различных матричных мРНК
1.2.1 Пробные трансляции для проверки зависимости интенсивности трансляции от количества мРНК
1.2.2 Трансляция мРНК актина с добавлением различного количества моноклональных антител к белку р40
1.2.3 Трансляция мРНК вируса гепатита С с добавлением различного количества антител к белку р40
1.2.4 Трансляция безлидерной мРНК фага X с добавлением различного количества антител к белку р40
2. Инициация трансляции на мРНК вируса гепатита С: влияние области нт. 1-40 на работу IRES’a
2.1 Исследование влияния различных мутаций домена I на работу IRES’a HCV
2.1.1 Создание мутантных конструкций
2.1.2 Удаление домена I повышает эффективность IRES-зависимой трансляции в 1,5-2 раза in vitro
2.1.3 Удаление домена I повышает эффективность IRES-зависимой трансляции в 4 раза в клетках печени человека и в 2 раза - в непеченочных клетках
2.1.4 Удаление домена I не влияет на способность IRES’a связывать малую субчастицу рибосомы
2.1.5 Кеп-структура стимулирует IRES-зависимую трансляцию конструкции дикого типа в 2 раза и не стимулирует трансляцию конструкции с удаленным доменом I

2.2 Два механизма трансляции на одной мРНК
IRES HCV может направлять трансляцию только со своего инициаторного кодона
3. Инициация трансляции на мРНК вируса гепатита С: роль З’-НТО
3.1 Создание химерных конструкций
3.2 З’-НТО вируса гепатита С не, стимулирует трансляцию, направляемую как IRES’om HCV, так и IRES’om PTV-1 in vitro
3.3 З’-НТО вируса гепатита С стимулирует трансляцию, направляемую как IRES’om HCV, так и IRES’om PTV-1 in vivo
3.4 Удаление разный областей З’-НТО HCV снижает эффективность IRES-зависимой трансляции
3.5 Стимуляция трансляции З’-НТО HCV не является следствием разной стабильности мРНК
3.6 Стимуляция трансляции З’-НТО HCV не зависит от механизма инициации
Выводы
Материалы и методы
Благодарности
Список литературы
Как видно из рис. 10 никакого влияния добавления белка р40 на эффективность образования бинарного комплекса не обнаруживается. Нами был сделан вывод, что добавление белка р40 если и увеличивает константу связывания, то лишь незначительно. Тогда с помощью проделанного эксперимента и при данных концентрациях компонентов мы просто не могли этого увидеть, поскольку константа связывания IRES-элемента с 40S субчастицей составляет 2 нМ [73]. Действительно, изотермы адсорбции, снятые нашими новосибирскими коллегами для данной системы, показали, что белок р40 увеличивает константу связывания IRES-элемента с 40S рибосомной субчастицей всего в 5 раз. Таким образом, белок р40 не является тем компонентом 40S субчастиц, который определяет уникальную особенность IRES-элемента РНК вируса гепатита С давать с ними прочные бинарные комплексы. Естественно, данный факт никак не исключает того, что р40 влияет на следующие после образования бинарного комплекса стадии образования инициаторного комплекса на мРНК вируса гепатита С.
1.2 Исследование необходимости белка р40 для трансляции различных матричных мРНК
Данное исследование мы проводили методом трансляции in vitro с использованием [358]-метионина. Трансляцию осуществляли в лизате ретикулоцитов кролика (Promega) с добавлением различных количеств моноклональных антител к исследуемому белку,