Свойства трехмерных матриксов из рекомбинантного спидроина 1

• Автор: Пустовалова, Ольга Леонидовна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил.

Содержание
1 Введение
2 Обзор литературы
2.1 Характеристика каркасного паутинного шелка Nephila яр
2.1.1 Строение каркасного гаелка ИеркИа ер
2.1.1.1 Первичная структура спидроинов ИеркИа эр
2.1.1.2 . Вторичная и третичная структуры спидроинов ИеркИа эр
2.1.1.3 Строение паутинной нити ЫеркИа ер
2.1.2 Физические свойства спидроинов каркасной нити паутины ЫеркИа ер
2.1.3 Конформационный переход и его влияние на свойства спидроинов АтеркИа эр
2.2 Рекомбинантные белки и белки-аналоги спидроинов: получение, свойства и возможности применения
2.2.1 Получение рекомбинантных аналогов паутинных белков
2.2.1.1 Синтез в бактериальных и дрожжевых клетках
2.2.1.2 Использование культурклеток животных в качестве продуцентов
2.2.1.3 Трансгенные растения
2.2.1.4 Трансгенные животные
2.2.2 Свойства рекомбинантных аналогов спидроинов
2.2.2.1 Модификация свойств рекомбинантных спидроинов
2.2.2.2 Генетическая модификация рекомбинантных белков и аналогов введением дополнителных последовательностей и создание кополимеров

2.2.3 Создание, получение и свойства белка 1й9 - аналога
спидроина 1 №рЫ1а с/аггра?
2.3 Использование шелка в биоинженерии
2.3.1. Природный паутинный шелк в биоинженерии
2.3.1 .1 Паутинный шелк естественного происхождения
2.3.1.2 Регенерированный паутинный шелк
2.3.2 Возможности биоинженерного применения рекомбинантных аналогов спидроинов
3 Материалы и методы
3.1 Материалы
3.1.2 Клеточные линии
3.2 Методы
3.2.1. Методы изготовления и модификации трехмерных матриксов и пленок
3.2.1 .1 Изготовление полимерных пленок и матриц
3.2.1.2 Модификация матриксов глутаровым альдегидом
3.2.1.3 Обработка полимерных матриксов коллагеном
3.2.2 Исследование физических, морфологических и топографических свойств матриксов
3.2.2 .1 Изучение структуры поверхности матриксов
3.2.2.2 Тест на соединенность пор матрицы
3.2.2.3 Сканирующая электронная микроскопия
3.2.2.4 Лазерная конфокальная микроскопия
3.2.2.5 Испытание деструкции матриксов
3.2.2.6 Изучение механических свойств пористых матриксов
3.2.3 Изучение влияния топографии матрикса на адгезию и пролиферацию эукариотических клеток

3.2.3.1 Культивирование клеток
3.2.3.2 Изучение адгезии и роста клеток в трехмерных матриксах и на поверхности полимерных пленок
3.2.3.3 Изучение распределения клеток в матрице
3.2.3.4 Определение жизнеспособности клеток при культивировании в матриксе из спидроина
3.2.3.5 Анализ количества клеток
3.2.4 Имплантация матриксов в подкожную ткань
3.2.4.1 Условия хирургического вмешательства и эксперимента52
3.2.5 Извлечение имплантата и подготовка образцов тканей
3.2.5.1 Фиксация образцов и подготовка к микроскопическим исследованиям
3.2.5.2 Подготовка срезов для гистологических исследований
3.2.5.3 Окраска срезов гематоксилином и эозином
3.2.6 Микроскопические исследованияимплантата
3.2.6.1 Световая микроскопия
3.2.6.2 Витальное окрашивание сосудов в имплантатах
4 Результаты и обсуждение
4.1 Физические, морфологические и топографические свойства матриксов из аналога спидроина
4.1.1 Макроструктура трехмерных матриксов
4.1.2 Микроструктура трехмерных матриксов
4.1.3 Деструкция матриксов из аналога спидроина
4.1.4 Механические свойства матриксов
4.2 Культивирование клеток в матрицах из рекомбинантного аналога спидроина

Многообещающие результаты применения изделий из шелка Bombyx mori стимулировало исследования шелка других шелкопрядов, превосходящих его по прочности и биосовместимости. Например, для создания трехмерных матриксов, способных поддерживать рост эукариотических клеток, с успехом использовали шелк шелкопрядов Antheraea mylitta [Acharya С. et al., 2008; Dash R. et al., 2007; Mandai B.B. and Kundu S.C., 2009a; Mandai B.B. and Kundu S.C., 2009c], Antheraea assama [Kasoju N. et al., 2009] и Antheraea pernyi [Kweon H. and Park Y.H., 2001; Li M. et al., 2008; Tsukada M. et al., 1994]. Активно изучаются свойства, структура и возможности биоинженерного применения шелка Samia cynthia ricini [Moriya M. et al., 2009; Nakazawa Y. and Asakura T., 2003].
Паутинный шелк не так широко распространен в хозяйственной деятельности, хотя примеры его практического использования известны уже в древности. Например, в Древней Греции паутинный шелк применялся для лечения ран. Аборигены Новой Гвинеи изготавливали из паутинного шелка традиционную одежду, рыболовецкие сети, сумки и головные уборы. В Австралии из липкого шелка гигантских тропических пауков делали рыболовецкие лески [Lewis R., 1996].
Попытки промышленного использования паутинного шелка предпринимались в Европе в 17-19 веках, но окончились неудачей, поскольку процедура получения шелка оставалось трудоемкой, а его количество недостаточным. В начале 18 века французский натуралист Rene-Antoine Ferchault de Reaumur использовала шелк яйцевых камер пауков для производства перчаток и носков. Следующую попытку использования шелка с теми же целями предпринял в середине того же века Bon de Saint-Hailaire. В обоих случаях организованные предприятия не были успешны из-за низкой рентабельности. Облегчить процедуру получения паутинного шелка помогло