Использование рекомбинационной инженерии для прецизионного изменения структуры, уровня экспрессии и механизмов регуляции генов в хромосоме Escherichia coli

• Автор: Крылов, Александр Александрович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Цель и задачи работы
Научная новизна и практическая значимость работы
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Рекомбинационная инженерия
1.2 Применение инструментария рекомбинационной инженерии в метаболической инженерии
1.2.1 Модификация структурной части гена
1.2.2 Искусственная активация экспрессии генов
1.2.3 Оптимизация экспрессии генов искусственных оперонов
1.2.4 Искусственное снижение экспрессии генов
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Штаммы
2.2 Плазмиды
2.3 Среды
2.4 Олигонуклеотиды
2.5 Проведение ПЦР
2.6 ПЦР тест для определения структуры rph
2.7 ПЦР с обратной транскрипцией
2.8 Генно-инженерные и микробиологические методики
2.9 Р1 трансдукция
2.10 Определение активностей ферментов в клеточных экстрактах
2.11 Электропорация/(электротрансформация вектором РАН 162) клеток E. coli
2.12 Red-зависимая интеграция фрагментов ДНК в бактериальную хромосому
2.13 Ф80-ЗАВИСИМАЯ интеграция фрагментов ДНК В БАКТЕРИАЛЬНУЮ ХРОМОСОМУ

2.14 Двумерный гель-электрофорез
2.15 Определение концентрации аминокислот
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Red-зависимое маркирование целевых локусов хромосомы
3.1.1 Природа мутации rph-1 и поиск вариантов rphM
3.1.2 Маркирование и трансдукцил локуса rph-pyrE из TG1 в MG1
3.1.3 Определение скорости роста штамма MG16552-[>77/jwt]
3.2 Метаболически регулируемая активация экспрессии целевых генов
3.2.1 Анализ параметров культивирования штамма DV
3.2.2 Конструирование РPh0uPsis-aroG4 методами рекомбинационной инженерии
3.2.3 Характеристика новых штаммов DV269-2-[PPhoA/Psis-aroG4]
3.3 Повышение уровня экспрессии дистальных цистронов искусственных оперонов за счет эффекта трансляционного сопряжения
3.3.1 Оценка эффективности экспрессии генов оперона P,ac.tdea-aroG4-serA5
3.3.2 Оптимизация экспрессии serA5 путем преобразования структуры оперона
3.3.4 Оценка уровня экспрессии гена serA5 в трицистронном опероне
3.3.5 Изучение влияния изменения уровня экспрессии serA5 на продукцию L-Trp
3.4 Снижение уровня экспрессии генов за счет искусственно организованной встречной транскрипции
3.4.1 Конструирование штаммов E. coli для исследования эффектов встречной транскрипции
3.4.2 Изучение конститутивного режима встречной транскрипции
3.4.3 Изучение регулируемого снижение уровня экспрессии генаpykF
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
Ser - серии L-Phe - фенилаланин L-Trp - триптофан L-Tyr —тирозин Глк - глюкоза Риб - рибоза
SD - последовательность Шайна-Далгарно
DAHPS - 3-дезокси-0-арабиногептулозонат-7-фосфат синтетаза
PhoA - щелочная фосфатаза Escherichia coli
PykF — пируват киназа Escherichia coli
Cat - хлорамфениколацетилтрансфераза
SerA5 - устойчивая к ретроингибированию Ser D-3-фосфоглицерат дегидрогеназа
AroG4 - устойчивая к ретроингибированию Phe DAHPS
Ар - ампицилин
Cm — хлорамфсникол
Km - канамицин
Тс - тетрациклин
ИПТГ - изопропилД-О-тиогалактопиранозид
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ОТ-ПІДР - ПІДР с обратной транскрипцией
Р, - неорганический фосфат
асРНК - анти-смысловая (anti-sense) РНК
Ест70 — кор-фермент РНК полимеразы E. coli в комплексе с а
Eos - кор-фермент РНК полимеразы E. coli в комплексе с as

Reporter operon
Variable TIGR secondary structures

TIGR assembly and amplification

2 — 4 0 Processing of TIGR-containing mRNA
ESS *>£c
Q TIGR oligo design

Variable
hairpins

Primary transcript

RNase E sites
Variable
hairpins
Secondary transcripts
Рисунок 1.6. Принцип метода оптимизации искусственного оперона на основе TIGR элементов (из Pfleger и др., 2006)
Общим недостатком подхода, и авторы сами указывают его, является интеграция в межгенную область множества участков, формирующих «шпильки» РНК, которые, как известно, повышают вероятность терминации транскрипции [Larson и др., 2008]. Данный факт увеличивает количество транскриптов проксимальных цистронов относительно дистальных и требует учета порядка следования генов в опероне при его изначальном конструировании. Однако неоспоримым преимуществом является получение множества различных соотношений экспрессии соседних цистронов за один акт модификации.
Еще два опубликованных на сегодняшний день способа оптимизации экспрессии цистронов искусственных оперонов предлагают варьировать порядок следования генов [Nakagawa и др., 2010; Bikard и др., 2010]. Отличие работ